الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em> كولاي</em> الوصيفة HdeB<em> في المختبر</em> و<em> في فيفو</em
Summary
توضح هذه الدراسة تقنيات الطبيعية الحيوية، والكيمياء الحيوية والجزيئية لوصف النشاط كوصي من الإشريكية القولونية HdeB في ظل الظروف الحامضية. وقد تم تطبيق هذه الأساليب بنجاح للمرافقين آخرين حامض واقية مثل HdeA ويمكن تعديل للعمل من أجل مرافقين آخرين وظروف الإجهاد.
Abstract
وكثيرا ما تتعرض البكتيريا لتغيرات بيئية، مثل التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وحالة الأكسدة، التعرض للضوء أو القوة الميكانيكية. العديد من هذه الشروط يسبب البروتين تتكشف في الخلية ويكون لها تأثير ضار على بقاء الكائن الحي. وقد أظهرت مجموعة من لا علاقة لها، المحرمين الجزيئي الإجهاد محددة للعب أدوار أساسية في بقاء هذه ظروف الإجهاد. في حين مطوية بالكامل وكوصي غير نشط قبل الإجهاد، وهذه البروتينات تتكشف بسرعة ويصبح-كوصي نشط تحت ظروف الإجهاد محددة. تنشيط مرة واحدة، وهذه مرافقين المختلين مشروط ربط عدد كبير من البروتينات المعرضة للتجميع مختلفة، ومنع تجميع وإما بشكل مباشر أو غير مباشر تسهيل بروتين refolding لدى عودته إلى الظروف غير الإجهاد. النهج الأساسي لاكتساب فهم أكثر تفصيلا حول آلية تفعيل والعميل الاعتراف بها ينطوي على تنقية وsubsequenر توصيف هذه البروتينات باستخدام فحوصات في المختبر كوصي. المتابعة في المقايسات إجهاد الجسم الحي ضرورية للغاية لتأكيد مستقل حصلت في نتائج المختبر.
يصف هذا البروتوكول في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لوصف النشاط كوصي من E. القولونية HdeB، وهو كوصي حمض تفعيلها. واستخدمت القياسات نثر الخفيفة، مريحة للقراءة خارج عن قدرة HdeB لمنع تجميع الناجم عن حمض من البروتين العميل نموذج المعمول بها، مليون درهم، في المختبر. طبقت التجارب تنبيذ فائق التحليلية للكشف عن تشكيل المعقد بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان البروتين عملائها، لتسليط الضوء على مصير البروتينات العميل لدى عودتهم إلى الظروف غير الإجهاد. وأجريت فحوصات النشاط الأنزيمية للبروتينات العميل لرصد آثار HdeB على تعطيل العميل الناجم عن درجة الحموضة وتنشيط. وأخيرا، استخدمت دراسات البقاء على قيد الحياة لرصد ومراقبةص تأثير وظيفة كوصي HdeB في الجسم الحي.
Introduction
والبيئة الطبيعية المشتركة التي مسببات الأمراض الميكروبية تجربة الظروف التي تتكشف البروتين الحمضية التي يسببها هي المعدة الثدييات (المدى درجة الحموضة 1-4)، التي تعد بمثابة حاجز فعال ضد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية 1 الرقم الهيدروجيني الحمضية. البروتين تتكشف والتجميع، والذي كان سببه الجانب الأحماض الأمينية سلسلة بروتوناتيون، ويؤثر على العمليات الحيوية، والأضرار الهياكل الخلوية ويتسبب في نهاية المطاف موت الخلية 1،2. منذ الرقم الهيدروجيني للالجبلة المحيطية البكتيرية equilibrates على الفور تقريبا مع درجة الحموضة البيئية بسبب نشر خالية من البروتونات عبر الغشاء الخارجي يسهل اختراقها، بروتينات غشاء محيط بالجبلة والداخلية من البكتيريا سالبة الجرام هي المكونات الخلوية الأكثر ضعفا في ظل الظروف الحمضية من الإجهاد 3. لحماية بروتيوم محيط بالجبلة ضد الضرر بوساطة حمض السريع، والبكتيريا سالبة الجرام الاستفادة من المحرمين محيط بالجبلة تنشيط حمض HdeA وHdeB. HdeA هو كوصي المختلين مشروط <sup> 4،5: في الرقم الهيدروجيني محايدة، HdeA غير بوصفها و، ديمر-كوصي غير نشط مطوية. بناء على التحول درجة الحموضة أقل من الرقم الهيدروجيني 3، وظيفة كوصي HdeA وسرعان ما تنشيط 6،7. تفعيل HdeA يتطلب تغييرات عميقة الهيكلية، بما في ذلك الانفصال حيز أحادية، والجزئي تتكشف أحادية 6-8. بمجرد تفعيلها، HdeA ترتبط بالبروتين التي تتكشف في ظل الظروف الحمضية. ويمنع على نحو فعال التجميع على حد سواء خلال حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني، وكذلك على تحييد الحموضة. لدى عودته إلى 7.0 درجة الحموضة، HdeA يسهل refolding من البروتينات عملائها بطريقة ATP مستقلة ويحول مرة أخرى إلى مثنوي، التشكل كوصي خاملا 9 منه. وبالمثل، كوصي HdeB مثلي والوصيفة-نشط أيضا في درجة الحموضة 7.0. على عكس HdeA، ومع ذلك، النشاط كوصي HdeB ويصل الحد الأقصى واضح في الرقم الهيدروجيني 4.0، الظروف التي لا تزال مطوية HdeB إلى حد كبير ومثنوي 10. وعلاوة على ذلك، مما خفض مركز دراسات الرقم الهيدروجينيوفاق لتثبيط HdeB. وتشير هذه النتائج أنه على الرغم من التماثل على نطاق واسع، HdeA وHdeB تختلف في طريقتهم في تفعيل وظيفي والسماح لهم لتغطية مجموعة ودرجة الحموضة واسع مع وظيفة كوصي الحمائية. واحد كوصي الأخرى التي تورطت في مقاومة الأحماض من E. القولونية هو Hsp31 حشوية، والذي يظهر على استقرار البروتينات العميل تكشفت حتى تتم استعادة الظروف محايدة. وضع دقيق للعمل Hsp31، ومع ذلك، ظلت غامضة 12. وبالنظر إلى أن البكتيريا ممرض للأمعاء أخرى مثل السالمونيلا تفتقر إلى الاوبرون hdeAB، فمن المحتمل جدا أن مرافقين محيط بالجبلة بعد مجهولين آخرين قد توجد التي تشارك في مقاومة الأحماض من هذه البكتيريا 11.
البروتوكولات المعروضة هنا تسمح لمراقبة النشاط كوصي تعتمد على درجة الحموضة من HdeB في التجارب المختبرية والحية 10 ويمكن تطبيقها للتحقيق مرافقين آخرينمثل Hsp31. بدلا من ذلك، شبكة معقدة من عوامل النسخ التي تتحكم في التعبير عن hdeAB من المحتمل أن يتم التحقيق من قبل في الجسم الحي الإجهاد الفحص. لتوصيف وظيفة كوصي من البروتينات في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على الاجهزة التجريبية المختلفة. طريق واحد هو تطبيق البروتين تتكشف ظروف الإجهاد وظاهريا تميز سلالات متحولة إما بإفراط عن الجينات في المصالح أو تحمل حذف هذا الجين. ويمكن إجراء دراسات البروتين لتحديد أي البروتينات لم يعد مجموع المباراتين تحت ظروف الإجهاد عندما كوصي هو الحاضر، أو تأثير كوصي على انزيم معين يمكن تحديده خلال ظروف الإجهاد باستخدام المقايسات الأنزيمية 14-16. في هذه الدراسة، اخترنا بإفراط HdeB في سلالة rpoH الحذف، التي تفتقر إلى الصدمة الحرارية عامل سيغما 32. RpoH تسيطر على التعبير عن كل E. كبير مرافقين القولونية وحذفها من المعروف أن زيادة السيناتورitivity لظروف الإجهاد البيئية التي تسبب البروتين تتكشف 15. تقرر في الجسم الحي النشاط كوصي من HdeB من خلال رصد قدرتها على قمع حساسية الرقم الهيدروجيني للسلالة Δ rpoH. وإجمالا، فإن البروتوكولات المعروضة هنا توفر نهج سريع ومباشر لوصف النشاط من كوصي الحمضية التي تنشط في المختبر وكذلك في سياق في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
من أجل دراسة آلية تفعيل وظيفة كوصي من HdeB، كميات كبيرة من HdeB يجب أن تكون أعرب وتنقيته. تتوفر لإنتاج مستويات عالية من بروتين الهدف، بما في ذلك pTrc أو pBAD ناقلات، وكلاهما المستخدمة في هذه الدراسة عدد من أنظمة ناقلات التعبير. المروجين يمكن الوصول إليها بسهولة لE. القول?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة كلوديا كريمرز لها النصيحة مفيدة على المقايسات كوصي. واعترف كين وان للحصول على المساعدة الفنية له في تنقية HdeB. وأيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (لJCAB) والمعاهد الوطنية للصحة منح RO1 GM102829 إلى JCAB وUJJ-UD يدعمها زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG).
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
Referências
- Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
- Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
- Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
- Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
- Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
- Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
- Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
- Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
- Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
- Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
- Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
- Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
- Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
- Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
- Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
- Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
- Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
- Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
