pH bağımlı aktivitenin tespiti<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> İn Vitro</em> ve<em> İn Vivo</em
Summary
Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.
Abstract
Bakteriler sıklıkla pH değişiklikleri, sıcaklık, redoks durumu, ışığa maruz kalma veya mekanik güç gibi çevresel değişikliklere maruz kalır. Bu durumların çoğu hücrede açılımı proteini neden organizmanın sağkalım üzerine olumsuz etkisi vardır. olmayan, stres-özel moleküler şaperonlar bir grup, bu stres koşullarında hayatta kalması gerekli roller oynadığı gösterilmiştir. Tamamen katlanmış ve hastabakıcı-inaktif stres önce, bu proteinler hızla açılmak ve spesifik stres koşulları altında hastabakıcı aktif hale iken. Bir kez bu koşullu düzensiz şaperonlar farklı toplama eğilimli proteinin çok sayıda bağlanan, aktive edilmiş, bunların birarada toplanmasını önlemek ve, ya doğrudan ya da dolaylı olarak non-stres koşullarına dönüş üzerine yeniden katlama proteini kolaylaştırır. onların aktivasyonu ve müşteri tanıma mekanizması hakkında daha ayrıntılı bir anlayış kazanıyor için birincil yaklaşım arınma ve subsequen içerirnitro şaperon deneyler kullanılarak bu proteinlerin t karakterizasyonu. In vivo stres deneyleri takip bağımsız in vitro sonuçlar elde onaylamak için kesinlikle gereklidir.
Bu protokol, E. şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlere tarif E. coli HdeB bir asit aktive şaperon. Işık saçılım ölçümleri, in vitro olarak, kurulu bir modeli istemci protein, MDH asit ile indüklenen, toplanmayı önlemek için HdeB kapasitesi için uygun bir okuma olarak kullanılmıştır. Analitik Ultrasantrifügasyon deneyleri non-stres koşullarına döndükten sonra müşteri proteinlerin kaderi içine ışık tutacak, HdeB ve müşteri protein LDH arasındaki karmaşık oluşumunu ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Müşteri proteinlerin enzimatik aktivite deneyleri pH kaynaklı müşteri inaktivasyonu ve reaktivasyon üzerinde HdeB etkilerini izlemek için yapılmıştır. Son olarak, hayatta kalma çalışmaları için kullanılmıştır monitoin vivo HdeB en şaperon fonksiyonunun etkisini r.
Introduction
Mikrobiyal patojenler asit kaynaklı protein elinde tutmasına koşulları tecrübe edildiği bir ortak doğal çevre olan asidik pH gıda kaynaklı patojenler 1 karşı etkili bir bariyer görevi görür memeli mide (pH aralığı 1-4) 'dir. Amino asit yan zinciri protonasyon nedeniyle protein açılması ve agregasyonu, biyolojik süreçleri, zarar hücresel yapıları etkileyen ve en sonunda hücre ölümüne 1,2 neden olur. Bakteriyel periplazmaya pH nedeniyle gözenekli dış zar boyunca proton serbest difüzyonuna neredeyse aynı anda, çevre pH dengeye için, Gram-negatif bakterilerin periplazmik ve iç membran proteinleri asit, gerilimli şartlar altında 3 en hassas hücre bileşenleri bulunmaktadır. Hızlı asit aracılı olduğu hasarlara karşı gösterdikleri periplazmik Proteomun korumak için, Gram-negatif bakteriler asit ile aktive edilmiş periplazmik şaperonlar HdeA ve HdeB kullanmaktadır. HdeA bir şartlı bozukluğu şaperonudur <sup> 4,5: nötr pH'da, HdeA katlanmış, şaperon hareketsiz dimer olarak mevcuttur. PH 3 altında bir pH kayması sırasında, HdeA en şaperon fonksiyonu hızla 6,7 etkinleştirilir. HdeA aktivasyonu monomerlerin 6-8 açılımı derin yapısal monomerlerin içine ayrışma dahil değişiklikleri, ve kısmi gerektirir. Bu işlemden sonra, HdeA asidik koşullar altında açığa proteinlerine bağlanır. Bu etkili bir düşük pH değerlerinde inkübasyon sırasında hem de pH nötrleştirme sırasında hem agregasyonunu engeller. PH 7.0'a dönüş üzerine, HdeA bir ATP-bağımsız bir şekilde, istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını kolaylaştırır ve dimerik, refakat-olmayan yapıya 9 geri dönüştürür. Benzer şekilde, benzer şaperon HdeB da refakat hareketsiz pH 7.0 ile kullanılmıştır. HdeA aksine, HdeB en şaperon aktivitesi, pH 4.0 HdeB hâlâ büyük oranda katlanır ve 10 dimerik olduğu koşullar altında, görünür maksimuma ulaşır. Ayrıca, daha fazla pH gevşeyebilir düşürücüHdeB inaktivasyonu es. Bu sonuçlar, büyük bir homoloji rağmen HdeA ve HdeB bunları koruyucu şaperon fonksiyonu ile geniş bir pH aralığı kapsayan sağlayan fonksiyonel bir aktivasyon tarzı açısından farklılık göstermektedir. E. asit direnci implike edilmiştir Diğer bir şaperon E. coli nötr koşullar restore kadar gelişeceğini istemci proteinleri stabilize görünen sitoplazmik Hsp31 vardır. Hsp31 en müdahale durumu net olarak, bununla birlikte, 12 anlaşılmaz kalmıştır. Salmonella gibi diğer enteropatojenik bakteriler hdeAB operonunu eksikliği göz önüne alındığında, diğer henüz kimliği belirlenemeyen periplazmik şaperonlar bu bakterilerin 11 asit direnci dahil olduğunu var olabilir kuvvetle muhtemeldir.
Burada yer alan protokol vivo 10 in vitro ve de HdeB pH bağımlı şaperon etkinliğini izlemek için izin diğer şaperonlar araştırmak için uygulanabilirHsp31 gibi. Seçenek olarak ise, hdeAB ifadesini kontrol transkripsiyon faktörleri karmaşık ağ potansiyel in vivo gerilme testi ile araştırılabilir. In vivo olarak, proteinlerin şaperon işlevini karakterize etmek için, farklı deney düzenekleri uygulanabilmektedir. Birinci yol proteinin açılımı stres koşullar uygulanır ve fenotipik iki ilgili geni aşırı ifade eden ya da genin bir silme taşıyan mutant türünü nitelendirilmesidir. Proteomik çalışmalar chaperone mevcut olduğu zaman, gerilimli şartlar altında, toplam artık bu proteinleri belirlemek için yapılabilir, ya da belirli bir enzimin bir şaperon etkisi Enzimatik 14-16 kullanılarak stres şartlarında belirlenebilir. Bu çalışmada, tüm büyük E. ekspresyonunu kontrol RpoH ısı şoku sigma faktörü 32. yoksun bir rpoH delesyon suşu içinde HdeB aşın tercih E. coli chaperones ve silme sens arttırdığı bilinmektedirprotein 15 açılımı neden olan çevresel stres koşullarına iTivity. HdeB in vivo şaperon aktivitesi Δ rpoH soyunun pH duyarlılığı bastırmak için kabiliyetini izleyerek tespit edilmiştir. Özet olarak, burada sunulan protokoller in vitro hem de in vivo bağlamında bir asit ile aktive edilmiş cinsten aktivitesinin karakterize edilmesi için hızlı ve basit bir yaklaşım sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
aktivasyonu ve HdeB bir şaperon fonksiyonu mekanizmasını araştırmak için, HdeB büyük miktarlarda ifade edilmiş ve saflaştırılmış gerekir. sentezleme vektör sistemleri bir dizi bu çalışmada kullanılmıştır, her ikisi de pTrc ya pBAD vektörleri de dahil olmak üzere, bir hedef proteinin yüksek seviyeleri üretimi için kullanılabilir. Destekleyiciler E. için kolayca erişilebilir E. coli RNA polimerazı ve bir E. HdeB böylece güçlü yukarı regüle getirilmesine…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Refakatçi deneyleri onu yararlı tavsiyeler Dr. Claudia Cremers teşekkür ederim. Ken Wan HdeB saflaştırma onun teknik yardım için kabul edilmektedir. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından sağlanan bir doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmektedir (JCAB için) Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve JCAB ve UJJ-UD Sağlık hibe RO1 GM102829 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
Referências
- Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
- Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
- Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
- Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
- Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
- Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
- Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
- Dahl, J. -. U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
- Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
- Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
- Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
- Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
- Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
- Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. i. n. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
- Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
- Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
- Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
- Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
