Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.
De bacteriën worden vaak blootgesteld aan veranderingen in de omgeving, zoals veranderingen in pH, temperatuur, redox status belichting of mechanische kracht. Veel van deze aandoeningen veroorzaken eiwitontvouwende in de cel en hebben nadelige invloed op de overleving van het organisme. Een groep van onafhankelijke, stress-specifieke moleculaire chaperones is aangetoond dat essentiële rol spelen bij de overleving van deze stresscondities. Terwijl volledig gevouwen en chaperonne-inactief voor stress, deze eiwitten snel ontvouwen en worden chaperone-actief onder specifieke stress-condities. Eenmaal geactiveerd, deze conditioneel wanordelijke chaperones binden aan een groot aantal verschillende aggregerende eiwitten voorkomen dat hun aggregatie en proteïne hervouwing bij terugkeer naar niet-stressomstandigheden direct of indirect vergemakkelijken. De primaire benadering voor het verkrijgen van een meer gedetailleerd begrip van het mechanisme van de activatie en client erkenning omvat de zuivering en subsequent karakterisering van deze eiwitten toepassing van in vitro assays chaperon. Follow-up in vivo stress-tests zijn absoluut essentieel om zelfstandig te bevestigen de in vitro resultaten.
Dit protocol beschrijft in vitro pt in vivo methoden om de chaperone activiteit van E. karakteriseren coli HdeB een zuur geactiveerde chaperonne. Lichtverstrooiingsmetingen werden gebruikt als geschikte uitlezing capaciteit HdeB om zuur-geïnduceerde aggregatie van een gevestigd model client eiwit, MDH voorkomen in vitro. Analytische ultracentrifugatie-experimenten werden toegepast op complexvorming tussen HdeB en haar opdrachtgever eiwit LDH onthullen, om licht te werpen op het lot van de cliënt eiwitten op hun terugkeer naar non-stress-condities. Enzymatische activiteit assays van de cliënt eiwitten werden uitgevoerd om de effecten van HdeB op pH geïnduceerde client inactivatie en reactivering controleren. Ten slotte werden de overleving studies gebruikt om Monitor de invloed van HdeB's chaperone functie in vivo.
Een gemeenschappelijke natuurlijke omgeving waarin microbiële ziekteverwekkers ervaren zuur-geïnduceerde eiwit ontvouwen omstandigheden is het zoogdier maag (pH 1-4), waarvan de zure pH fungeert als een effectieve barrière tegen voedsel overgedragen pathogenen 1. Eiwitontvouwende en aggregatie, die wordt veroorzaakt door aminozuurzijketen protonering, beïnvloedt biologische processen, schade celstructuren en uiteindelijk leidt tot celdood 1,2. Aangezien de pH van het bacteriële periplasma in evenwicht vrijwel onmiddellijk de pH van het milieu door de vrije diffusie van protonen door de poreuze buitenste membraan periplasmische en binnenste membraan eiwitten van Gram-negatieve bacteriën zijn de meest kwetsbare cellulaire componenten onder zure-stressomstandigheden 3. Om hun periplasmische proteoom tegen snelle-zuur bemiddelde schade te beschermen, Gram-negatieve bacteriën maken gebruik van de zuur geactiveerde periplasmatische chaperones HdeA en HdeB. HdeA is een voorwaardelijk ontregeld chaperonne <sup> 4,5: Bij neutrale pH, HdeA aanwezig als een gevouwen, chaperone-actief dimeer. Bij een pH-verschuiving onder pH 3, wordt HdeA's chaperone functie snel geactiveerd 6,7. Activering van HdeA vereist ingrijpende structurele veranderingen, inclusief de dissociatie in monomeren en de gedeeltelijke ontvouwing van de monomeren 6-8. Eenmaal geactiveerd HdeA bindt aan eiwitten die zich ontvouwen onder zure omstandigheden. Het voorkomt effectief hun aggregatie, zowel tijdens de incubatie bij lage pH alsmede op pH neutralisatie. Bij terugkeer naar pH 7,0, HdeA vergemakkelijkt het opnieuw vouwen van zijn cliënt eiwitten in een ATP-onafhankelijke wijze en zet terug in zijn dimeer, chaperonne-inactieve conformatie 9. Ook de homologe chaperon HdeB ook chaperone-inactief bij pH 7,0. In tegenstelling tot HdeA echter HdeB's chaperone activiteit bereikt haar ogenschijnlijke maximum bij pH 4,0, onder welke voorwaarden HdeB is nog grotendeels gevouwen en dimeer 10. Bovendien verdere verlaging van de pH causes de inactivatie van HdeB. Deze resultaten suggereren dat ondanks hun uitgebreide homologie, HdeA en HdeB verschillen in hun wijze van functionele activatie waarbij zij een breed pH-traject met hun beschermende chaperone functie dekken. Een andere chaperone die is betrokken bij de zuurbestendigheid van E. coli is de cytoplasmatische Hsp31, die lijkt te ongevouwen client eiwitten te stabiliseren tot neutrale omstandigheden worden hersteld. De precieze werkingsmechanisme Hsp31's, echter, is raadselachtig 12 gebleven. Aangezien andere enteropathogene bacteriën zoals Salmonella niet de hdeAB operon, is het zeer waarschijnlijk dat andere ongeïdentificeerde periplasmatische chaperons kunnen bestaan die betrokken zijn bij zuurbestendigheid van deze bacteriën 11 zijn.
De protocollen die hier laat de pH-afhankelijke chaperone activiteit van HdeB controleren in vitro pt in vivo 10 en kunnen worden toegepast op andere chaperons onderzoekenzoals Hsp31. Als alternatief, het complex netwerk van transcriptiefactoren die de expressie van hdeAB controle kan mogelijk worden onderzocht door de spanning in vivo assay. Om de chaperone functie van eiwitten in vivo te karakteriseren, kan verschillende experimentele opstellingen worden toegepast. Een route naar eiwitontvouwende stressomstandigheden toepassing en fenotypische karakterisatie van mutante stammen die hetzij overexpressie het gen van belang of een bij deletie van het gen. Proteomics studies kunnen worden uitgevoerd om eiwitten te identificeren die niet langer aggregaat stressomstandigheden als de chaperonne aanwezig is, of de invloed van een chaperonne op een specifiek enzym kan tijdens stressomstandigheden middels enzymatische assays 14-16 bepaald. In deze studie hebben we ervoor gekozen om HdeB overexpressie in een rpoH deletie stam, die de warmte shock sigma factor 32. rpoH de expressie van alle belangrijke E. controleert ontbeert coli chaperones en de deletie bekend sens vergrotenItivity ecologische stress omstandigheden die eiwitontvouwende 15 veroorzaken. De in vivo activiteit van chaperone HdeB werd bepaald door het volgen zijn vermogen om de pH gevoeligheid van de Δ rpoH stam onderdrukken. In totaal protocollen die hier zorgen voor een snelle en eenvoudige benadering om de activiteit van een zuur geactiveerde chaperone karakteriseren in vitro als in in vivo context.
Om het mechanisme van activering en chaperone functie van HdeB bestuderen, grote hoeveelheden HdeB moet expressie gebracht en gezuiverd. Verschillende expressie vectorsystemen zijn beschikbaar voor de productie van hoge niveaus van een doelwiteiwit, waaronder pTrc of pBAD vectoren, die beide werden gebruikt in deze studie. De promotors zijn gemakkelijk toegankelijk zijn voor E. coli RNA polymerase en laten dan sterk opgereguleerd expressie van HdeB in een E. coli stam. Dit aspect is bijzonder rel…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Dr. Claudia Cremers voor haar nuttig advies over chaperon assays. Ken Wan is erkend voor zijn technische bijstand in HdeB zuivering. Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute (tot JCAB) en de National Institutes of Health subsidie RO1 GM102829 om JCAB en Ujj-UD wordt ondersteund door een postdoctoraal research fellowship van de Duitse Research Foundation (DFG).
NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Tris | Amresco | 0826-5kg | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
NADH | Sigma | N8129-100MG | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
Oligonucleotides | Invitrogen | ||
Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |