의 pH에 의존 활동의 검출<em> 대장균</em> 보호자 HdeB<em> 체외</em> 및<em> 생체</em
Summary
이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.
Abstract
박테리아 흔히 pH의 변화, 온도, 산화 환원 상태, 노광 또는 기계적 힘 등의 환경 변화에 노출된다. 이러한 조건 중 많은 셀 전개 단백질 원인 유기체의 생존에 불리한 영향을 미친다. 무관 스트레스 특정 분자 샤페론의 그룹이 스트레스 조건의 생존에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 완전히 접혀 및 보호자 – 비활성 스트레스 전에,이 단백질은 빠르게 전개 및 특정 스트레스 조건에서 chaperone 단백질을 활성화하는 동안. 일단 이들 조건 무질서 샤페론 다른 응집 경향 많은 단백질에 결합 활성, 그 응집을 방지하고, 직접 또는 간접적으로 비 응력 조건에 따라 반환 폴딩 단백질을 용이하게한다. 자신의 활성화 및 클라이언트 인식의 메커니즘에 대한 자세한 이해를 얻기위한 기본 접근 방식은 정화 및 subsequen을 포함시험관 샤페론 분석에서 사용하는 이들 단백질의 t 특성화. 생체 스트레스 분석에 후속 독립적으로 시험 관내 결과에서 얻어진 확인할 절대적으로 필수적이다.
이 프로토콜은 E.의 샤프론 활성을 특성화하기 위해 시험 관내 및 생체 내 방법에 대해 설명 콜라이 HdeB, 산 – 활성화 된 샤페론. 광산란 측정은 시험 관내에서, 설정된 모델 클라이언트 단백질 MDH의 산 – 유도 된 응집을 방지하기 HdeB 용량 편리한 판독을 사용 하였다. 분석 초 원심 분리 실험은 아닌 스트레스 조건에 자신의 복귀에 따라 클라이언트 단백질의 운명에 빛을 창고에, HdeB 및 클라이언트 단백질 LDH 사이의 복합체 형성을 나타 내기 위해 적용되었다. 클라이언트 단백질의 효소 활성 분석법을 pH 유도 클라이언트 비활성화 및 활성화에 HdeB의 효과를 모니터링하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 생존 연구 과정 제어하는 데 사용 된생체 내에서 HdeB의 보호자 기능의 영향을 r에.
Introduction
미생물 병원체가 산에 의한 단백질 전개 상황을 경험하는 일반적인 자연 환경은 그 산성 pH 식중독 병원균 1에 대한 효과적인 장벽 역할을하는 포유류 위 (pH 범위 1-4)입니다. 아미노산 측쇄 양성자로 인한 단백질 응집 펼쳐지는 생물학적 과정, 손상 세포 구조에 영향을 미치며, 결국 세포 사멸 1,2-시킨다. 박테리아 페리 플라 즘의 pH 의한 다공질 외측 막을 통한 양성자의 자유로운 확산을 거의 즉시 환경 pH를 평형화하기 때문에, 그람 음성 박테리아의 주변 세포질과 내막 단백질 산 스트레스 조건 3 하에서 가장 취약한 세포 성분이다. 빠른 산 – 매개 손상에 대한 자신의 주변 세포질 프로테옴을 보호하기 위해, 그람 음성 세균은 산 활성화 주변 세포질 보호자 HdeA 및 HdeB을 사용한다. HdeA는 조건 흐트러 보호자입니다 <sup> 4,5 : 중성 pH에서 HdeA가 접혀, 보호자 – 비활성 이합체로 존재한다. pH가 3 이하의 pH 변화에 따라, HdeA의 보호자 기능은 신속 6,7 활성화됩니다. HdeA의 활성화는 단량체 6-8의 전개 깊은 구조 단량체로는 해리를 포함하여 변경 및 부분이 필요합니다. 활성화되면, HdeA은 산성 조건 하에서 전개 단백질에 결합한다. 그것은 효과적으로 낮은 pH에서 배양하는 동안뿐만 아니라 pH를 중화에 모두 자신의 응집을 방지 할 수 있습니다. pH가 7.0 반환에, HdeA는 ATP 독립적 인 방식으로 자사의 클라이언트 단백질의 접힘을 용이하게하고 이량 체, 샤페론 비활성 형태 9로 다시 변환합니다. 마찬가지로, 동성 보호자 HdeB은 샤페론 비활성화되어 pH가 7.0에서. HdeA 달리, HdeB의 보호자 활동, pH가 4.0에서 HdeB 여전히 크게 접힌 10 이량되고있는 조건을 겉보기 최대에 도달한다. 또한, 상기 pH를 저하 CAUSHdeB의 비활성화 말이지. 이러한 결과는 광범위한 유사성에도 불구하고 HdeA HdeB은 그들의 보호 샤페론 기능 넓은 pH 범위를 커버 할 수 있도록 기능을 활성화 모드들이 다르다는 것을 제시한다. E.의 내산성에 관여 한 또 다른 보호자 대장균은 중립 상태가 복원 될 때까지 펼쳐진 클라이언트 단백질을 안정화 나타나는 세포질 Hsp31이다. Hsp31의 작용의 정확한 모드는, 그러나, 12 수수께끼 남아있다. 살모넬라와 같은 다른 장내 유해 세균이 hdeAB 오페론이 부족한 점을 감안, 다른 아직 미확인 주변 세포질 보호자가이 박테리아 (11)의 내산성에 관여하는 것을있을 수 있습니다 가능성이 높다.
여기에 제시된 프로토콜은 생체 열 관내 및 HdeB에서의 pH 의존성 샤페론 활성을 모니터링 할 수 있도록 다른 샤페론을 조사하기 위해 적용 할 수있다Hsp31 등. 대안 적으로, hdeAB의 발현을 조절하는 전사 인자의 복잡한 네트워크는 잠재적으로 생체 내 응력 분석에 의해 조사 할 수있다. 생체 내에서 단백질의 샤페론 기능을 특성화하기 위해 상이한 실험 설정을 적용 할 수있다. 하나의 경로는 단백질 전개 응력 조건을 적용 표현형 중 관심의 유전자를 과발현 또는 유전자의 삭제를 수행하는 변이주를 특징 화하는 것이다. 프로테오믹스 연구가 보호자가 존재하면 응력 조건 집합을 더 이상 어떤 단백질들을 식별하기 위해 수행 될 수도 있고, 특정 효소의 샤페론의 영향 효소 분석법 14-16을 사용하여 응력 조건에서 측정 할 수있다. 이 연구에서 우리는 모든 주요 E.의 발현을 제어 RpoH 열 충격 시그마 인자 (32)이 부족 rpoH 삭제 변형에 HdeB를 과발현하기로 결정했습니다 콜라이 샤페론 및 삭제는 SENS 증가하는 것으로 알려져단백질 (15)을 전개 발생할 환경 스트레스 조건 itivity. HdeB의 생체 샤페론 활성은 Δ rpoH 균주의 pH 민감성을 억제하는 능력을 모니터하여 측정 하였다. 전체적으로 여기에 제시된 프로토콜은 시험 관내에서뿐만 아니라 생체 내 환경에서 산 활성화 샤페론 활성을 특성화하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
활성화 및 HdeB의 샤페론 기능의 메커니즘을 연구하기 위해, HdeB 다량이 발현되고 정제 될 수있다. 발현 벡터 시스템의 숫자는이 연구에 사용 하였다 둘 PTRC 또는 pBAD 벡터를 포함하는 목적 단백질의 높은 수준의 생산에 사용할 수있다. 발기인은 E.에 대해 쉽게 접근 할 수 있습니다 대장균 RNA 중합 효소 및 E.에서 HdeB의 이렇게 강하게 상향 조절 허용 식 대장균 균주. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 보호자의 분석에 그녀의 도움이 조언 박사 클라우디아 Cremers 감사합니다. 켄 완은 HdeB 정화에 자신의 기술 지원을 인정 받고 있습니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)에서 제공하는 박사 연구 친교에 의해 지원됩니다 (JCAB에) 하워드 휴즈 의학 연구소 JCAB 및 UJJ-UD에 보건 부여 RO1 GM102829 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
Referências
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