Detección de la actividad dependiente del pH de<em> Escherichia coli</em> Acompañante HdeB<em> In Vitro</em> y<em> En Vivo</em

Summary

Este estudio describe las técnicas biofísicas, bioquímicas y moleculares para caracterizar la actividad chaperona de Escherichia coli HdeB en condiciones de pH ácido. Estos métodos se han aplicado con éxito para otros chaperones ácido-protectores tales como HdeA y puede ser modificado para trabajar para otros chaperones y condiciones de estrés.

Abstract

Las bacterias están expuestos con frecuencia a los cambios ambientales, tales como alteraciones en el pH, la temperatura, el estado redox, exposición a la luz o fuerza mecánica. Muchas de estas condiciones causar desplegamiento de la proteína en la célula y tienen un impacto perjudicial sobre la supervivencia del organismo. Un grupo de las chaperonas moleculares no relacionadas, estrés específica se ha demostrado que desempeñan papeles esenciales en la supervivencia de estas condiciones de estrés. Mientras totalmente plegada y chaperona-inactivo antes de estrés, estas proteínas se despliegan rápidamente y se convierten en chaperona-activa bajo condiciones de estrés específicos. Una vez activadas, estas chaperonas condicionalmente desordenadas se unen a un gran número de diferentes proteínas de agregación propensos, prevenir su agregación y facilitar directa o indirectamente la proteína de replegamiento a su regreso a condiciones de no estrés. El enfoque principal para obtener una comprensión más detallada sobre el mecanismo de activación de su reconocimiento y el cliente implica la purificación y subsequent caracterización de estas proteínas utilizando pt ensayos in vitro de chaperona. El seguimiento pt los ensayos in vivo de estrés son absolutamente esenciales para confirmar de manera independiente la obtenida en los resultados in vitro.

Este protocolo describe en vitro y pt métodos in vivo para caracterizar la actividad chaperona de E. coli HdeB, una chaperona-ácido activado. Mediciones de dispersión de luz se utilizaron como un cómodo lectura de salida para la capacidad de HdeB para evitar la agregación inducida por ácido de una proteína cliente modelo establecido, MDH, in vitro. ultracentrifugación analítica experimentos se aplicaron a revelar la formación de complejos entre HdeB y su proteína LDH cliente, para arrojar luz sobre la suerte de proteínas cliente a su regreso a condiciones de no estrés. Se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimática de las proteínas cliente de monitorizar los efectos de HdeB en la inactivación cliente pH inducida y la reactivación. Por último, se utilizaron estudios de supervivencia al monitor la influencia de la función chaperona de HdeB in vivo.

Introduction

Un entorno natural común en el que los patógenos microbianos experimentan condiciones que se desarrollan de proteínas inducidas por ácido es el estómago de mamíferos (intervalo de pH 1-4), cuyo pH ácido sirve como una barrera efectiva contra los patógenos transmitidos por los alimentos ^1. Desplegamiento de la proteína y la agregación, que es causada por la protonación de la cadena lateral de aminoácido, afecta a los procesos biológicos, estructuras celulares daños y eventualmente causa la muerte celular ^1,2. Dado que el pH de la periplasma bacteriano se equilibra de forma casi instantánea con el pH del medio ambiente debido a la difusión libre de protones a través de la membrana externa porosa, proteínas de la membrana periplásmicas e interior de las bacterias Gram-negativas son los componentes celulares más vulnerables en condiciones ácidas-estrés ^3. Para proteger su proteoma periplásmico contra el daño mediado por ácido rápida, las bacterias Gram-negativas utilizan las chaperonas periplásmicas ácido activado HdeA y HdeB. HdeA es una chaperona condicionalmente desordenado <sup> 4,5: A pH neutro, HdeA está presente como un doblado, dímero chaperona-inactivo. Tras un cambio de pH por debajo de pH 3, la función chaperona de HdeA se activa rápidamente ^6,7. La activación de HdeA requiere profundos cambios estructurales, incluyendo su disociación en monómeros, y el que se desarrollan parcial de los monómeros ^6-8. Una vez activado, HdeA une a las proteínas que se desarrollan en condiciones ácidas. Se evita con eficacia su agregación, tanto durante la incubación a pH bajo, así como la neutralización del pH. A su regreso a pH 7,0, HdeA facilita el repliegue de sus proteínas cliente de una manera independiente de ATP y la convierte de nuevo en su dimérica, la conformación inactiva ^chaperón-9. Del mismo modo, la HdeB chaperona homóloga también se chaperona inactiva a pH 7,0. A diferencia de HdeA, sin embargo, la actividad chaperona de HdeB alcanza su máximo aparente a pH 4,0, condiciones en las que se HdeB todavía en gran parte doblada y diméricas ^10. Por otra parte, reduciendo aún más las caus pHes la inactivación de HdeB. Estos resultados sugieren que a pesar de su extensa homología, HdeA y HdeB difieren en su modo de activación funcional que les permite cubrir un amplio rango de pH con su función protectora chaperona. Una otra chaperona que se ha implicado en la resistencia a los ácidos de E. coli es el citoplasmática Hsp31, que aparece para estabilizar proteínas cliente desplegadas hasta que se restablecen las condiciones neutrales. El modo preciso de acción de Hsp31, sin embargo, se ha mantenido enigmática ^12. Teniendo en cuenta que otras bacterias enteropatógenas tales como Salmonella carecen del operón hdeAB, es muy probable que puedan existir otras chaperonas periplásmicas aún no identificados que están involucrados en la resistencia de estas bacterias ácido ^11.

Los protocolos presentados aquí permiten controlar la actividad chaperona dependiente del pH de HdeB in vitro e in vivo ¹⁰ y se pueden aplicar para investigar otros chaperonestales como Hsp31. Alternativamente, la red compleja de factores de transcripción que controlan la expresión de hdeAB potencialmente puede ser investigada mediante el ensayo de estrés in vivo. Para caracterizar la función de chaperón de las proteínas in vivo, diferentes configuraciones experimentales se pueden aplicar. Una ruta es aplicar desplegamiento de la proteína condiciones de estrés y fenotípicamente caracterizar las cepas mutantes que sobreexpresan o bien el gen de interés o llevar una deleción del gen. Los estudios proteómicos pueden llevar a cabo para identificar las proteínas que ya no agregada en condiciones de estrés cuando la chaperona está presente, o la influencia de un acompañante en una enzima específica se pueden determinar durante condiciones de estrés utilizando métodos enzimáticos ^14-16. En este estudio, se optó por sobreexpresan HdeB en una cepa de deleción rpoH, que carece del factor sigma de choque térmico 32. RpoH controla la expresión de los principales E. chaperones coli y su eliminación se sabe que aumenta sensitivity a condiciones de estrés ambiental que causan desplegamiento de la proteína ^15. La actividad chaperona in vivo de HdeB se determinó mediante el control de su capacidad para suprimir la sensibilidad pH de la cepa Δ rpoH. En total, los protocolos presentados aquí proporcionan un enfoque rápido y directo para caracterizar la actividad de una chaperona-ácido activado in vitro, así como en el contexto in vivo.

Protocol

1. Expresión y purificación de periplásmico HdeB NOTA: HdeB se expresó en E. células de E. coli que albergan el plásmido pTrc- hdeB 10, y se purificó a partir del periplasma tras la lisis polimixina. Preparar un cultivo nocturno de E. coli células que albergan el plásmido pTrc- hdeB 10 en 30 ml de LB que contiene 200 mg / ml de ampicilina (LB Amp). Inocular cuatro 1 culturas L de LB Amp y crecer a 37 ° C…

Representative Results

HdeA y HdeB son homólogas E. proteínas coli, conocidos para proteger proteínas periplásmicas contra condiciones de estrés ácido 10. Nuestro trabajo reveló que al igual que HdeA, HdeB también funciona como un ácido activado chaperona molecular. Sin embargo, en contraste con funciones HdeA, HdeB a un pH que todavía es potencialmente bactericida, pero significativamente más alto que el pH óptimo de HdeA 6,9,10,22. Para investigar el pH óp…

Discussion

Con el fin de estudiar el mecanismo de la activación y la función chaperona de HdeB, grandes cantidades de HdeB tienen que ser expresado y purificado. Un número de sistemas de vectores de expresión están disponibles para la producción de altos niveles de una proteína diana, incluyendo pTrc o pBAD vectores, ambos de los cuales se utilizaron en este estudio. Los promotores son fácilmente accesibles para E. coli RNA polimerasa y la expresión de este modo permiten fuertemente upregulated de HdeB en c…

Materials

NEB10-beta E. coli cells	New England Biolabs	C3019I
Ampicillin	Gold Biotechnology	A-301-3
LB Broth mix, Lennox	LAB Express	3003
IPTG	Gold Biotechnology	I2481C50
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-10
Tris	Amresco	0826-5kg
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
Polymyxin B sulfate	ICN Biomedicals Inc.	100565
0.2 UM pore sterile Syringe Filter	Corning	431218
HiTrap Q HP (CV 5 ml)	GE Healthcare Life Sciences	17-1153-01
Mini-Protean TGX, 15%	Bio-Rad	4561046
Malate dehydrogenase (MDH)	Roche	10127914001
Potassium phosphate (Monobasic)	Fisher Scientific	BP362-500
Potassium phosphate (Dibasic)	Fisher Scientific	BP363-1
F-4500 fluorescence spectrophotometer	Hitachi	FL25
Oxaloacetate	Sigma	O4126-5G
NADH	Sigma	N8129-100MG
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9390-2.5KG
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S397-500
Lactate dehydrogenase (LDH)	Roche	10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392764	https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/
Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled	Beckman Coulter	306493
AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place	Beckman Coulter	363782
Wizard Plus Miniprep Kit	Promega	A1470	used for plasmid purification (Protocol 5.1)
L-arabinose	Gold Biotechnology	A-300-500
Glycine	DOT Scientific Inc	DSG36050-1000
Fluorescence Cell cuvette	Hellma Analytics	119004F-10-40
Oligonucleotides	Invitrogen
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530S
dNTP set	Invitrogen	10297018
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-500
Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL	Millipore	UFC900324
Centrifuge Avanti J-26XPI	Beckman Coulter	393127
Varian Cary 50 spectrophotometer	Agilent Tech
Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa	Spectrum Laboratories	132650
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K	Millipore	UFC803024
SDS	Fisher Scientific	bp166-500
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher	4375786