Une nouvelle technique de production et d'observation de chimiluminescence en milieu biologique
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
Au cours des dernières décennies, les technologies d'imagerie ont révolutionné la façon dont les médecins à diagnostiquer et de surveiller la maladie. Ces techniques d'imagerie, cependant, ont été largement limitée à des systèmes d'imagerie du corps entier, comme la tomographie par émission de positrons (PET), le photon unique par émission de positrons (SPECT), tomographie assistée par ordinateur (CT) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Une attention particulière a été accordée au cancer, et des percées technologiques d'imagerie ont grandement amélioré la façon dont cette maladie est diagnostiquée et traitée. Malgré ces progrès, il y a un endroit où ces technologies d'imagerie ne correspondent tout simplement pas: la salle d'opération. Bien que les techniques d'imagerie du corps entier peut aider à la planification chirurgicale, ils manquent généralement des résolutions spatiales suffisamment élevées pour aider les médecins à déterminer en temps réel si tout le tissu tumoral a été enlevé ou de tissu tumoral résiduel reste caché aux marges chirurgicales 1. Faire en sorte que pas infiltrativemarges tumorales sont laissés est l'un des objectifs chirurgicaux les plus importants, et les chirurgiens doivent marcher un corde raide entre la résection des tissus rigoureux et prudent. Si trop est enlevé, les effets secondaires indésirables pour le patient sont exacerbés; si trop peu est enlevé, les taux de récidive sont augmentés de 2, 3. Par conséquent, il est essentiel de définir des marges tumorales précises, et nous croyons que l'imagerie peropératoire chimioluminescent peut aider à améliorer la précision de l'identification des marges tumorales en aidant les chirurgiens de visualiser les tissus malins qui pourraient autrement ne pas être détectés avec des techniques établies.
Il existe de nombreuses technologies d'imagerie actuellement étudiés pour leur utilité possible que les systèmes d'imagerie peropératoire. Ceux – ci comprennent des sondes ß et γ-émettant un rayonnement 4, la fluorescence optique 5, Raman spectroscopie 6 </sup>, 7 et Cherenkov luminescence 8, 9. À ce jour, cependant, aucune de ces sont établies comme des outils cliniques standard. l'imagerie de fluorescence optique a jusqu'ici avéré être le plus prometteur de ces techniques et est donc le plus exploré. Bien qu'il ait déjà été révélé être un outil précieux pour de nombreuses applications, il ne va pas sans limitations. En effet, son principal inconvénient est la fluorescence de fond généré par le tissu biologique intrinsèquement autofluorescents. Ce signal de fond autofluorescente est un produit de l'excitation du tissu environnant, en plus du fluorophore, par la source de lumière externe nécessaire pour la production d'un signal fluorescent. Du point de vue pratique, cette autofluorescence peut potentiellement conduire à de faibles rapports signal sur bruit, ce qui peut limiter l'utilité de cette technologie dans la salle d'opération.
Le principalavantage de l'imagerie par chimioluminescence sur l'imagerie de fluorescence est qu'aucune lumière d'excitation est nécessaire. Par conséquent, il n'y a pas de fond d'autofluorescence. En imagerie par chimiluminescence, l'énergie d'excitation est générée au lieu chimiquement. Ce procédé ne produit aucun signal de fond non voulue et peut donc entraîner une augmentation des rapports signal sur bruit. Cela pourrait finalement conduire à la détection plus précise et exacte des marges chirurgicales. Assez étonnamment, l'utilité de cette approche comme une technique d'imagerie peropératoire est restée inexplorée 10. En effet, l'exemple le plus proche de cette technique est l'oxydation du luminol par la myéloperoxydase chez les souris 11, 12, 13. imagerie biomédicale chimioluminescente est donc un domaine assez inexploré de la recherche qui pourrait offrir les avantages suivants: (1) autofluorescence minimale résultant en un signal de fond bas avec salutle rapport signal-bruit gher; (2) les longueurs d'onde accordables d'émissions chimioluminescentes allant du visible au proche infrarouge; et (3) complexes chimiluminescents fonctionnalisables qui, lorsqu'il est combiné avec les technologies de liaison et de biomolécules qui existent déjà ciblées, donnent accès à des bibliothèques entières de sondes d'imagerie moléculaire ciblées 14.
Cette étude de validation de principe illustre l'utilité potentielle d'imagerie chimioluminescent dans le milieu biomédical à l'aide d'un agent d'imagerie à base de ruthénium. Les propriétés chimioluminescentes de ce composé sont bien étudiés, des enquêtes datant du milieu des années 1960 15. Lors de l' activation chimique, l'agent produit de la lumière à environ 600 nm 16, ce qui est bien adapté à des fins d'imagerie médicale. L'énergie d'activation est fourni par une réaction d'oxydoréduction qui conduit à un état-excité qui a une durée de vie de 650 ns dans l' eau 17 -folldue par la génération de photons lors du relâchement de cet état excité. Grâce à l'utilisation d'un nébulisateur à distance spécialement conçu, nous avons pu détecter le composé à la fois ex vivo et in vivo. Les résultats des premières expériences sont très prometteurs, ce qui suggère une enquête plus approfondie de cette technologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une technologie qui est capable de délimiter le tissu optiquement par l'intermédiaire de l'émission de photons créés par un rapporteur chimioluminescent. Contrairement à d' autres, plus établi, les technologies 4, 5, 6, 7, 8, 9, ce système rapporteur chimioluminescent utilise une son…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
Referências
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