שיטה חדשנית עבור chemiluminescence יצירה וההתבוננות בסביבה ביולוגית
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
בעשורים האחרונים, טכנולוגיות הדמיה חוללו מהפכה באופן שבו רופאים לאבחן ולנטר מחלות. טכנולוגיות הדמיה אלה, עם זאת, היו מוגבלים בעיקר למערכות הדמיה הגוף כולו, כגון טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT), טומוגרפיה ממוחשבת (CT), תהודה מגנטית (MRI). תשומת לב מיוחדת הוקדשה סרטן, ופריצות דרך הדמיה טכנולוגית שיפרו באופן ניכר את הדרך כי מחלה זו מאובחנת ומטופלת. למרות ההתפתחויות הללו, יש מקום אחד שבו טכנולוגיות הדמיה אלה פשוט לא מתאימים: בחדר הניתוח. בעוד שיטות הדמיה הגוף יכול לעזור בתכנון כירורגי, הם בדרך כלל חסרי החלטות מרחבית גבוהה מספיק כדי לעזור לרופאים לקבוע בזמן אמת אם כל רקמת הגידול הוסר או רקמת הגידול שיורית נשאר מוסתר בשולי כירורגית 1. שים לב שאף infiltrativeשולי גידול נשארים מאחור הוא אחת המטרות כירורגי החשובות ביותר, ומנתחים חייבים ללכת על חבל בין כריתת רקמה הקפדנית וזהירה. אם יותר מדי מוסר, תופעות לוואי בלתי רצויות עבור המטופל הם החריפו; אם מעט מדי מוסר, שיעורי הישנות גדלו 2, 3. לכן, חשוב להתוות שולי גידול מדויקים, ואנו מאמינים כי הדמיה תוך ניתוחית chemiluminescent יכולה לעזור לשפר את הדיוק של זיהוי של שולי גידול על ידי עוזר למנתחים לדמיין רקמות ממאירות שיכול אחרת להישאר מבלי שיבחין בו עם טכניקות הוקמו.
ישנן טכנולוגיות הדמיה רבות נחקרות כעת עבור השירות האפשרי שלהם כמו מערכות הדמיה תוך ניתוחיות. אלה כוללים בדיקות β- ו פולט γ-קרינה 4, אופטית קרינה 5, ספקטרוסקופיית ראמאן 6 </sup>, 7, ו Cherenkov הארה 8, 9. עד כה, עם זאת, כל אלה לא הפכו הוקם ככלים קליניים רגילים. דימות פלואורסצנטי אופטי עד כה הוכיחה להיות המבטיחים ביותר של טכניקות אלה היא אפוא בחנו ביותר. אמנם זה כבר הוכח להיות כלי רב ערך עבור יישומים רבים, זה לא בלי המגבלות. ואכן, החסרון העיקרי שלה היא קרינת הרקע שנוצרה על ידי רקמה ביולוגית מטבעו autofluorescent. אות הרקע autofluorescent זהו מוצר של עירור של הרקמה הסובבת, בנוסף fluorophore, על ידי מקור אור חיצוני הדרושים לייצור אות ניאון. מנקודת מבט מעשי, autofluorescence הללו עשויים להוביל יחסי אות לרעש נמוכים, אשר יכול להגביל את התועלת של טכנולוגיה זו בחדר הניתוח.
המנהליתרון של הדמית chemiluminescence על דימות פלואורסצנטי הוא שאף אור עירור הוא הכרחי. כתוצאה מכך, אין autofluorescence רקע. בשנת הדמית chemiluminescence, אנרגית עירור במקום מופקת כימית. תהליך זה לא מייצר אות רקע לא מכוונת ולכן יכול לגרום יחסי אות לרעש גבוהים. בסופו של דבר זה עלול לגרום זיהוי מדויק יותר ומדויק של שולים כירורגית. באופן מפתיע במקצת, את התועלת של גישה זו כטכניקת הדמיה תוך ניתוחית נותרה 10 נחקרה. ואכן, הדוגמה הקרובה ביותר בטכניקה זו הוא חמצון של לומינול ידי myeloperoxidase בעכברים 11, 12, 13. הדמית ביו Chemiluminescent לכן אזור נחקר למדי של מחקר שיכול להציע את היתרונות הבאים: (1) autofluorescence המינימאלית וכתוצאה מכך אות רקע נמוכה עם ההייאות לרעש gher יחסי; (2) באורכי גל מתכונן פליטות chemiluminescent החל גלוי קרוב אינפרא אדום; ו (3) מתחמי chemiluminescent functionalizable כי, בשילוב עם טכנולוגיות מקשרות וממוקדים ביומולקולות שכבר קיימות, לספק גישה לספריות שלמות של בדיקות הדמיה מולקולריות ממוקדות 14.
הוכחה של עיקרון זה מחקר ממחיש את התועלת הפוטנציאלית של הדמית chemiluminescent בסביבה ביו באמצעות סוכן הדמיה מבוסס רותניום. המאפיינים chemiluminescent של תרכובת זו נלמדים היטב, עם חקירות שראשיתה באמצע שנות ה -1960 15. עם ההפעלה כימית, הסוכן מפיק אור בסביבות 600 ננומטר 16, וזה גם מתאים למטרות הדמיה רפואיות. אנרגיית השפעול מסופק על ידי תגובה חיזור שמוביל מדינה-אשר נרגש יש תוחלת חיים של 650 ננו-שניות במים 17 -follחוב על ידי הדור של פוטונים על הרפיה של מדינה מתרגשת זה. באמצעות השימוש של nebulizer מרחוק ומעוצב, הצלחנו לזהות את המתחם הוא vivo לשעבר in vivo. תוצאות הניסויים הראשוניים הם מאוד מבטיח, דבר המצביע על חקירה נוספת של טכנולוגיה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, יש לנו הצגתי טכנולוגיה שמסוגלת המגדיר רקמות אופטיות באמצעות פליטת הפוטונים נוצרו על ידי עיתונאי chemiluminescent. בניגוד אחר, מבוסס יותר, טכנולוגיות 4, 5, 6, 7, 8, 9, מ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
Referências
- Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. . Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. , (2015).
- Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation – a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13 (9), 653-662 (2013).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41 (3), 166-181 (2011).
- van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17 (10), 1315-1319 (2011).
- Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (25), E2288-E2297 (2013).
- Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
- Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53 (9), 1438-1445 (2012).
- Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55 (1), 95-98 (2014).
- Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15 (4), 455-461 (2009).
- Lee, J. -. J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49 (29), 3016-3018 (2013).
- Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6 (10), 765-769 (2007).
- Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2 (12), 1025-1030 (2010).
- Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88 (1), 170-202 (2016).
- Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88 (20), 4745-4746 (1966).
- Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
- Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. . Handbook of Photochemistry 3rd Ed. , 379-404 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. , (2016).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9 (3), 371-381 (1956).
- Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
- Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
- Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54 (5), 663-670 (1965).
- Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. . IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. , (1983).
- Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
- Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112 (8), 2949-2957 (2008).
- Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84 (6), 2769-2775 (2012).
- Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
- Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21 (40), 14146-14155 (2015).
- Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9 (5), 1146-1159 (2014).
- Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).
- Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).
- Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
- Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
- Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).
