生物学的設定における生成と観測化学発光のための新しい技術
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
ここ数十年では、イメージング技術は、医師が病気を診断し、監視する方法に革命をもたらしてきました。これらのイメージング技術は、しかしながら、例えば、陽電子放射断層撮影（PET）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（SPECT）、コンピュータ断層撮影（CT）、磁気共鳴イメージング（MRI）などの全身画像化システムに大きく制限されています。特に注意は、がんが注目されている、技術イメージングブレークスルーを大幅にこの病気を診断し、治療される方法を改善しています。手術室：これらの進歩にもかかわらず、これらのイメージング技術がちょうど収まりきらない一つの場所があります。全身イメージング技術は、手術計画に役立つことができますが、それらは一般的に、腫瘍組織の全てが除去された又は残留腫瘍組織を切除縁1に隠されたままかどうかを医師がリアルタイムで決定するのに役立つのに十分に高い空間分解能を欠いています。ノー浸潤がしていることを確認し腫瘍マージンが最も重要な外科的な目標の一つであり、外科医は、厳格かつ慎重な組織切除の間にタイトロープを歩く必要があります残されています。あまりに多くが除去されると、患者に対する望ましくない副作用が悪化します。少なすぎるが削除された場合、再発率は2、3に増加しています。したがって、正確な腫瘍のマージンを描くために重要であり、我々は、化学発光術中イメージングは、そうでなければ、確立された技術で検出されない状態になる可能性があり、悪性組織を可視化するために外科医を支援することにより、腫瘍のマージンの識別の精度を向上させるために助けることができると信じています。
現在術中イメージングシステムとしてのそれらの可能な有用性について研究されている多くのイメージング技術があります。これらは、β-およびγ線放出プローブ4、光学蛍光5、ラマン分光法6を含みます</sup> 7、及びチェレンコフ発光8、9。しかし、今日まで、これらのいずれも、標準的な臨床ツールとして確立されていません。光学蛍光イメージングは、これまで、これらの技術の中で最も有望であることが判明している、したがって、最も探索されます。既に多くの用途のための貴重なツールであることが示されているが、それには限界がないわけではありません。確かに、その主な欠点は、本質的に自家蛍光生体組織によって生成されたバックグラウンド蛍光です。このバックグラウンド自己蛍光シグナルは、蛍光シグナルの生成に必要な外部光源により、フルオロフォアに加えて、周囲の組織の励起との積です。実用的な観点から、この自己蛍光は、潜在的に手術室では、この技術の有用性を制限することができる低信号対雑音比をもたらすことができます。
校長蛍光画像上の化学発光画像化の利点は、励起光が必要でないことです。その結果、バックグラウンド自己蛍光はありません。化学発光イメージングでは、励起エネルギーは、代わりに、化学的に生成されます。このプロセスには意図されないバックグラウンド信号を生成しないので、より高い信号対雑音比をもたらすことができます。これは、最終的に切除縁のより精密かつ正確に検出される可能性があります。やや驚くべきことに、術中イメージング技術として、このアプローチの有用性は、10未踏のままです。実際、この手法に最も近い例は、マウス11、12、13におけるミエロペルオキシダーゼによるルミノールの酸化です。化学発光生物医学イメージングは、したがって、次のような利点を提供できる研究のかなり未踏の領域です：ハイとローバックグラウンド信号が得られる（1）最小限の自家蛍光gher信号対雑音比。 （2）可視光から近赤外までの化学発光放出の調整可能な波長を、 （3）リンカ技術とすでに存在している標的とする生体分子と結合し、官能化化学発光錯体を、対象となる分子イメージングプローブ14の全体のライブラリへのアクセスを提供します。
この証明の原理研究は、ルテニウムベースの造影剤を使用して、生物医学的環境において化学発光画像化の潜在的な有用性を示しています。この化合物の化学発光特性は、よく1960年代半ば15にさかのぼる調査で、研究されています。化学的活性化の際に、薬剤は、医療用イメージングのために適している約600 nmの16の光を生成します。活性化エネルギーは、励起状態の水17 -follで650ナノ秒の寿命を有するに至る酸化還元反応によって提供されますこの励起状態の緩和時に光子の生成によって負っ。特別に設計されたリモートネブライザーの使用を介して、我々は、化合物の両方のエキソビボおよびインビボで検出することができました。最初の実験の結果は、この技術のさらなる調査を示唆し、非常に有望です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、光学的、化学発光レポーターによって作成された光子の放出を介して組織の輪郭を描くことのできる技術を提示しています。他のとは対照的に、多くのこの化学発光レポーター系は、非放射性であり、非常に高感度レベルでの検出を容易に画像化プローブを用い、技術4、5、6、7、8?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
Referências
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