تقنية جديدة لتوليد ومراقبة التوهج في إعداد البيولوجي
Summary
This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.
Abstract
Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.
Introduction
في العقود الأخيرة، أحدثت ثورة في تقنيات التصوير الطريقة التي الأطباء في تشخيص ومراقبة المرض. هذه تقنيات التصوير، ومع ذلك، كانت محدودة إلى حد كبير لنظم التصوير الجسم كله، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)، واحد الفوتون الانبعاثات التصوير المقطعي (SPECT)، التصوير المقطعي (CT)، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). وقد تم إيلاء اهتمام خاص للسرطان، واختراقات التصوير التكنولوجية قد تحسنت بشكل كبير الطريقة أن هذا المرض يتم تشخيص وعلاج. وعلى الرغم من هذا التقدم، هناك مكان واحد حيث هذه التقنيات التصوير فقط لا تناسب: غرفة العمليات. بينما تقنيات تصوير الجسم كله يمكن أن تساعد في تخطيط العمليات الجراحية، أنهم يفتقرون عادة قرارات مكانية عالية بما فيه الكفاية لمساعدة الأطباء على تحديد في الوقت الحقيقي عما إذا كانت جميع أنسجة الورم تمت إزالته أو أنسجة الورم المتبقية لا تزال مخبأة على هامش الجراحية 1. التأكد من أن أي إختراقيوتترك هوامش ورم خلف هو واحد من الأهداف الجراحية الأكثر أهمية، ويجب أن الجراحين يسيرون على حبل محكم بين استئصال الأنسجة صرامة وحذرا. إذا تمت إزالة أكثر من اللازم، وتتفاقم الآثار الجانبية غير المرغوب فيها بالنسبة للمريض. إذا القليل جدا هو إزالتها، وزادت معدلات تكرار 2، 3. لذلك، من الأهمية بمكان لتحديد هوامش ورم دقيقة، ونحن نعتقد أن التصوير أثناء العملية chemiluminescent يمكن أن تساعد على تحسين دقة تحديد هوامش الورم من خلال مساعدة الجراحين على تصور الأنسجة الخبيثة التي يمكن أن تبقى على خلاف ذلك لم يتم كشفها مع التقنيات المعمول بها.
هناك العديد من تقنيات التصوير يجري التحقيق حاليا لفائدة ممكنة من حيث نظم التصوير أثناء العملية. وتشمل هذه بيتا وانبعاث γ والاشعاعات وتحقيقات 4، مضان بصري 5، رامان الطيفي 6 </sup> و 7 و Cherenkov التلألؤ 8 و 9. حتى الآن، ومع ذلك، فقد أصبح إنشاء أيا من هذه كأدوات السريرية القياسية. التصوير مضان البصرية وقد ثبت حتى الآن أن تكون واعدة أكثر من هذه التقنيات، وبالتالي هو الأكثر استكشافها. في حين سبق أن ثبت أن تكون أداة قيمة للعديد من التطبيقات، فإنه لا يخلو من حدودها. في الواقع، العيب الرئيسي هو مضان الخلفية التي تولدها الأنسجة البيولوجية autofluorescent بطبيعتها. هذه إشارة الخلفية autofluorescent هي نتاج استثارة الأنسجة المحيطة بها، بالإضافة إلى fluorophore، من مصدر الضوء الخارجي اللازم لتوليد إشارة الفلورسنت. من منظور عملي، وهذا يمكن تألق ذاتي يحتمل أن يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، والتي يمكن أن تحد من جدوى هذه التقنية في غرفة العمليات.
مدير المدرسةميزة التصوير التوهج على التصوير مضان هو أنه لا يوجد ضوء الإثارة ضروري. ونتيجة لذلك، ليس هناك تألق ذاتي الخلفية. في التصوير التوهج، وبدلا من ذلك إنشاء طاقة الإثارة كيميائيا. وتنتج هذه العملية أي إشارة الخلفية غير مقصودة، وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع نسب الإشارة إلى الضوضاء. وهذا يمكن أن يؤدي في نهاية المطاف إلى الكشف عن أكثر دقة ودقة من هوامش الجراحية. إلى حد ما يثير الدهشة، ظلت جدوى هذا النهج باعتباره تقنية التصوير أثناء العملية غير مستكشفة 10. في الواقع، وأقرب مثال لهذه التقنية هو أكسدة مينول التي كتبها الميلوبيروكسيديز في الفئران 11 و 12 و 13. لذا التصوير الطبي الحيوي Chemiluminescent هي منطقة غير مستكشفة بدلا من الأبحاث التي يمكن أن تقدم المزايا التالية: (1) تألق ذاتي الحد الأدنى مما أدى إلى إشارة خلفية منخفضة مع مرحباgher نسب الإشارة إلى الضوضاء. (2) موجات الانضباطي من انبعاثات chemiluminescent تتراوح ما بين مرئية للبالقرب من الأشعة تحت الحمراء. و (3) مجمعات chemiluminescent functionalizable أنه عندما جنبا إلى جنب مع تقنيات رابط والجزيئات الحيوية الموجودة بالفعل المستهدفة، وتوفير الوصول إلى مكتبات كاملة من تحقيقات التصوير الجزيئي المستهدفة 14.
وتوضح هذه الدراسة إثبات صحة مبدأ الفائدة المحتملة من التصوير chemiluminescent في الإعداد الطب الحيوي باستخدام عامل التصوير القائم على الروثينيوم. خصائص chemiluminescent من هذا المركب ومدروسة، مع التحقيقات التي يعود تاريخها إلى منتصف 1960s 15. عند التنشيط الكيميائي، وكيل وتنتج الضوء في حوالي 600 نانومتر 16، والتي هي مناسبة تماما لأغراض التصوير الطبي. يتم توفير طاقة التنشيط خلال تفاعل الأكسدة التي تؤدي إلى متحمس للدولة التي لديها حياة 650 نانو ثانية في الماء 17 -follالمستحقة على جيل من الفوتونات على تخفيف هذه الحالة المثارة. من خلال استخدام البخاخات عن بعد مصممة خصيصا لهذا الغرض، وكنا قادرين على اكتشاف مركب على حد سواء خارج الحي وفي الجسم الحي. نتائج التجارب الأولية واعدة جدا، مما يشير إلى مزيد من التحقيق في هذه التكنولوجيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، قدمنا التكنولوجيا التي هي قادرة على ترسيم بصريا الأنسجة عن طريق انبعاث الفوتونات التي أنشأتها مراسل chemiluminescent. وعلى النقيض من الآخر، أكثر رسوخا والتكنولوجيات 4، 5، 6، 7، 8?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.
Materials
| Wood part A (12.5×2.5×1.8 cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part B (12.7×10.7×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Wood part C (11×2.5×1.8cm) | Woodcraft | 131404 | Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet |
| Screws (4×25 mm) | Screwfix | 79939 | |
| Harmon Face Values 3oz mini sprayer | Bed, Bath and Beyond | ||
| stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel) | Metals Depot Int. Inc. | 2192 | |
| Pencil Classic HB | Papermate | 58592 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| speaker cable | RCA Inc. | AH1650SN | |
| Energizer 9V alkaline battery | Energizer Holdings Inc. | EN22 | |
| Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4kg/cm output torque @ 6V | Hitech RCD USA Inc. | 32082S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 28 cm plastic cable ties | General Electric Inc. | 50725 | |
| Duct tape | 3M Inc. | 3939 | |
| littleBits w1 wire | littleBits Inc. | w1 wire | |
| littleBits p1 power | littleBits Inc. | p1 power | |
| littleBits i2 toggle switch | littleBits Inc. | i2 toggle switch | |
| littleBits 011 servo | littleBits Inc. | 011 servo | |
| 20 cm plastic covered wire twist ties | Four Star Plastics | 71TIE8000 | |
| Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma-Aldrich Inc. | 224758 | |
| Ammonium cerium(IV) nitrate | Sigma-Aldrich Inc. | 22249 | |
| Isofluorane | Baxter Healthcare | 1001936060 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | PBS1 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2854 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich Inc. | T0886 | |
| Water | Water was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ) | ||
| Female nude (outbred) mice | Jackson Laboratories | 1929 | age 5 – 6 weeks |
| Strain C57BL/6J | |||
| NU/J male mice at | Jackson Laboratories | 2019 | age 6 – 8 weeks |
| IVIS 200 bioluminescence reader | Caliper Live Science | ||
| Live Image 4.2 software | Perkin-Elmer | 128165 | |
| Microscope slides | ThermoScientific | 4951PLUS4 |
Referências
- Fong, Y., Giulianotti, P. C., Lewis, J., Koerkamp, B. G., Reiner, T. . Imaging and Visualization in The Modern Operating Room: A Comprehensive Guide for Physicians. , (2015).
- Nguyen, Q. T., Tsien, R. Y. Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation – a new cutting edge. Nat. Rev. Cancer. 13 (9), 653-662 (2013).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452, 580-589 (2008).
- Heller, S., Zanzonico, P. Nuclear probes and intraoperative gamma cameras. Semin. Nucl. Med. 41 (3), 166-181 (2011).
- van Dam, G. M., et al. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-α targeting: first in-human results. Nat. Med. 17 (10), 1315-1319 (2011).
- Zavaleta, C. L., et al. A Raman-based endoscopic strategy for multiplexed molecular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (25), E2288-E2297 (2013).
- Harmsen, S., Bedics, M. A., Wall, M. A., Huang, R., Detty, M. R., Kircher, M. F. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nat. Commun. 6, 1-9 (2015).
- Thorek, D. L., et al. Positron Lymphography: Multimodal, High-Resolution, Dynamic Mapping and Resection of Lymph Nodes After Intradermal Injection of 18F-FDG. Nucl. Med. 53 (9), 1438-1445 (2012).
- Thorek, D. L. J., Riedl, C. C., Grimm, J. Clinical Cerenkov Luminescence Imaging of 18F-FDG. Nucl. Med. 55 (1), 95-98 (2014).
- Gross, S., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15 (4), 455-461 (2009).
- Lee, J. -. J., White, A. G., Rice, D. R., Smith, B. D. In vivo imaging using polymeric nanoparticles stained with near-infrared chemiluminescent and fluorescent squaraine catenane endoperoxide. Chem. Commun. 49 (29), 3016-3018 (2013).
- Lee, D., et al. In vivo imaging of hydrogen peroxide with chemiluminescent nanoparticles. Nat. Mater. 6 (10), 765-769 (2007).
- Baumes, J. M., et al. thermally activated, near-infrared chemiluminescent dyes and dye-stained microparticles for optical imaging. Nat. Chem. 2 (12), 1025-1030 (2010).
- Siraj, N., et al. Fluorescence, Phosphorescence, and Chemiluminescence. Anal. Chem. 88 (1), 170-202 (2016).
- Hercules, D. M., Lytle, F. E. Chemiluminescence from Reduction Reactions. Am. Chem. Soc. 88 (20), 4745-4746 (1966).
- Kerr, E. Annihilation electrogenerated chemiluminescence of mixed metal chelates in solution: modulating emission colour by manipulating the energetics. Chem. Sci. 6, 472-479 (2015).
- Montalti, M., Credi, A., Prodi, L., Gandolfi, M. T. . Handbook of Photochemistry 3rd Ed. , 379-404 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rhodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Büchel, G. E., et al. Near-infrared intraoperative chemiluminescent imaging. ChemMedChem. , (2016).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and Listening to Light: the Evolution of Whole-Body Photonic Imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Koch, J. H., Gyarfas, E. C., Dwyer, F. P. Biological Activity of Complex Ions Mechanism of Inhibition of Acetylcholinesterase. Austral. J. Biol. Sci. 9 (3), 371-381 (1956).
- Juris, A., Balzani, V., Barigelletti, F., Campagna, S., Belser, P., Zelewsky, A. V. Ru(II) polypyridine complexes: photophysics, photochemistry, electrochemistry, and chemiluminescence. Coord. Chem. Rev. 84, 85-277 (1988).
- Knoll, J. D., Turro, C. Control and utilization of ruthenium and rhodium metal complex excited states for photoactivated cancer therapy. Coord. Chem. Rev. 282, 110-126 (2015).
- Haley, T. J. Pharmacology and toxicology of the rare earth elements. J. Pharm. Sci. 54 (5), 663-670 (1965).
- Siekierski, S., Mioduski, T., Salomon, M. . IUPAC Commission on Solubility Data. Solubility Data Series. Vol 13. Scandium, Yttrium, Lanthanum, and Lanthanide Nitrates. , (1983).
- Reiner, T., Jantke, D., Marziale, A. N., Raba, A., Eppinger, J. Metal-Conjugated Affinity Labels: A New Concept to Create Enantioselective Artificial Metalloenzymes. ChemistryOpen. 2, 50-54 (2013).
- Zanarini, S., et al. Synthesis and Electrochemiluminescence of a Ru(bpy)3-Labeled Coupling Adduct Produced on a Self-Assembled Monolayer. J. Phys. Chem. C. 112 (8), 2949-2957 (2008).
- Liu, R., Lv, Y., Hou, X., Yang, L., Mester, Z. Protein Quantitation Using Ru-NHS Ester Tagging and Isotope Dilution High-Pressure Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Determination. Anal. Chem. 84 (6), 2769-2775 (2012).
- Jantke, D., et al. Synthetic strategies for efficient conjugation of organometallic complexes with pendant protein reactive markers. J. Organomet. Chem. 744, 82-91 (2013).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J Neurooncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Forster, R. J., Bertoncello, P., Keyes, T. E. Electrogenerated Chemiluminescence. Annual Rev. Anal. Chem. 2, 359-385 (2009).
- Connell, T. U., James, J. L., White, A. R., Donnelly, P. S. Protein Labelling with Versatile Phosphorescent Metal Complexes for Live Cell Luminescence Imaging. Chem. Eur. J. 21 (40), 14146-14155 (2015).
- Zhou, X., et al. Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe. Nat. Protoc. 9 (5), 1146-1159 (2014).
- Bœuf, G., et al. Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy. ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).
- Loizidou, M., Seifalian, A. M. Nanotechnology and its applications in surgery. Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).
- Barry, N. P. E., Sadler, P. J. Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future. ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).
- Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand. Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).
- Truong, J., et al. Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand. Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).
