استخدام 3D تكنولوجيا الطباعة لدمج التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة: بروتوكول لالدماغ باجتزاء
Summary
ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو محاذاة بدقة التصوير بالرنين (التصوير بالرنين المغناطيسي) مجلدات صورة المغناطيسية مع أقسام الأنسجة عن طريق إنشاء أصحاب الدماغ مطبوعة 3D حسب الطلب وصناديق تقطيع اللحم.
Abstract
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
Introduction
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المذكورة هنا يمكن إجراء مقارنة دقيقة بين التصوير بالرنين المغناطيسي وأقسام الأنسجة. ويقدم البروتوكول في شكل موحد يمكن تطبيقه على أدمغة البشر أو الحيوانات الصغيرة، مثل النسناس أو القوارض. خلافات محددة لكبير (الإنسان) والصغيرة (الرئيسيات غير البشرية والقوارض) ويسلط الضوء على العقول، وفي الفيديو والشخصيات المرافقة ونحن لشرح التطبيق في القشة قرد أميركي. على الرغم من أن نهج واضح وصريح، يتطلب طريقة العديد من الخطوات فضلا عن استخدام عدة أنواع من البرمجيات. وعلاوة على ذلك، العديد من القضايا يحتمل أن يؤثر على دقة هذه الطريقة مهمة لذكرها.
جودة الصورة في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي هو عامل مهم. للحد من التفاوت في دقة وضوح الصورة بين التصوير بالرنين المغناطيسي والصور الأنسجة رقمية، وينبغي استخدام أصغر حجم ممكن التصوير بالرنين المغناطيسي فوكسل. وينطبق هذا المفهوم أيضا على جودة الصورة من التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة. في حين ارتفعتاكتساب الوقت في التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة يسمح أعلى بكثير دقة وضوح الصورة، وإعداد يمكن إدخال القطع الأثرية صورة مثل التسرب إشارة التنسيق المتعلقة فقاعات الهواء. ويمكن لهذه القطع الأثرية تحجب مجالات النسيج وكذلك يؤثر على كفاف. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن تتأثر عملية تثبيت ومدة أبعاد الأنسجة على التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة. بينما في الجسم الحي إلى خارج الجسم الحي مباراة التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن يقترب عن كثب من خلال الاستفادة من المعالم التشريحية في الإعداد الهندسة شريحة خلال الاستحواذ، فإن التسجيل غير الخطية لا يزال ضروريا للوصول إلى درجة عالية من الدقة في مطابقة هذين صور الرنين المغناطيسي.
تصميم حامل الدماغ وتقطيع اللحم هو أيضا خطوة حاسمة. في خلق نموذج رقمي للمخ، يتم تطبيق بالمرشح الذي يوسع قليلا نموذج قريب إلى الدماغ ثابتة. وهذا يتيح الإدراج سهلة من الدماغ إلى حاملها وتقطيع اللحم ويقلل من الحواف الحادة في حامل و# 39؛ ق كفاف. ومع ذلك، إذا كان النموذج هو كبير جدا (على سبيل المثال، من خلال أكثر من 5٪)، قد ينتقل الدماغ خلال التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة و / أو باجتزاء. نقطة أخرى مهمة هي للتكيف مع تصميم نموذج الدماغ بحيث يتم وضع المخيخ بشكل صحيح داخل الكائن 3D المطبوعة. هذا يمكن أن يكون تحديا من نوع خاص عندما تم تلف المخيخ خلال استخراج المخ في تشريح الجثة.
عند طباعة تقطيع الدماغ وحامل، نوع الطابعة 3D يجب أن يتم اختيار بعناية. تتطلب بعض الطابعات متعددة طائرة مرحلة ما بعد المعالجة باستخدام الفرن لإزالة الدعم المادي. في حين أن هذه الطابعات يمكن أن تنتج الأشياء التي هي ماء وأكثر دواما نسبيا من سطح المكتب تنصهر ترسب النمذجة (FDM) طابعات، عملية التسخين لإزالة الدعم يمكن أن تشوه قليلا مربع، وخلق الثغرات شفرة ليست عمودية تماما على كفاف الدماغ.
عملية الدماغ باجتزاء هي خطوة حاسمة أخرى. قبل قطع الالبريد الدماغ كله إلى ألواح، من المهم للتأكد من أن الدماغ هو يجلس بإحكام داخل تقطيع الدماغ: يجب أن يكون هناك حركة عندما يتم تطبيق ضغط طفيف على الدماغ. وهذا سيجعل من الممكن للشفرات لقطع طريق الدماغ في الموقع الدقيق الذي حدده المحققين. وينبغي تطبيق والضغط المتوازن المستمر على كل من أصحاب شفرة عندما قطع. اعتمادا على حدة من ريش وصلابة من الأنسجة، ويمكن طفيف عرضية قطع الحركة يكون من المفيد للحفاظ على قطع الأسطح المسطحة.
يمكن أيضا أن تكون عملية دمج البارافين مصدر الاختلال بين التصوير بالرنين المغناطيسي والأنسجة. إذا كان لوح الأنسجة لا يجلس شقة ضد الكاسيت أثناء عملية التضمين، وسوف يكون هناك ميل بين الطائرة قطع مشراح والمكان سطح البلاطة. وهذا يتطلب قطع الأجزاء غير صالحة للاستعمال لإيجاد منبسط التي تتعرض كل الأنسجة. طريقة واحدة لتصحيح الميلهو عن طريق تغيير زاوية من الطائرة عرض على تشريح التصوير بالرنين المغناطيسي عالية الخواص الدقة. ومع ذلك، وهذا هو المستحيل تقريبا على اداء في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي الذي عادة ما يتم الحصول عليها مع قرار متباين الخواص (عادة شرائح الاكليلية سميكة).
وأخيرا، يمكن للأنسجة تجربة بعض التشوه خلال الفترة الفورمالين التثبيت وتضمينها البارافين (انكماش)، وكذلك أثناء إعداد الشرائح (قابلة للطي، وتكسير، التجاعيد). بعض هذه التشوهات يمكن تصحيحها عن طريق وضع 4-5 ميكرون المقاطع في حمام الماء قبل نقل على الشرائح. تشوهات أخرى يمكن حلها جزئيا عن طريق أداء coregistration صورة تشوه الصور الرقمية النسيجية إلى الصور التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الوفاة. ومع ذلك، والتقليل من التشوهات مع الممارسة المتأنية والماهرة هو النهج الأكثر فعالية لمطابقة كميات التصوير بالرنين المغناطيسي لعلم الأنسجة أقسام.
في الختام، فإن منهجية قدم هنا تمكن الجردestigators إجراء تقييم دقيق لعلم الأمراض الكامنة وراء النتائج التصوير بالرنين المغناطيسي. أكثر عموما، بل هو نهج واعد لتحديد و / أو التحقق من صحة المؤشرات الحيوية التصوير بالرنين المغناطيسي الجديدة للدراسات البحثية التي تستهدف العمليات المرضية محددة، مثل التهاب أو عودة الميالين.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
Materials
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software | |
Referências
- Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
- ‘t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
- Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
- Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
- Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
- Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
- McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
- Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
- Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
- Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
- Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).
