Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, genau zu der Magnetresonanztomographie (MRT) Bildvolumen mit Histologieschnitten über die Erstellung von kundenspezifischen 3D-gedruckten Gehirn Halter und Slicer Boxen ausrichten.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Das Protokoll hier skizzierte ermöglicht einen genauen Vergleich zwischen MRT und Histologie Abschnitte. Das Protokoll wird in einem einheitlichen Format dargestellt, das Gehirn von Menschen oder Kleintieren, wie Nagetieren oder marmosets angewendet werden kann. Bedingte Unterschiede zu groß (Mensch) und kleine (nicht-menschlichen Primaten und Nagetieren) Gehirne markiert sind, und im zugehörigen Video und Figuren zeigen wir die Anwendung in der Seidenäffchen. Obwohl das Konzept einfach ist, erfordert das Verfahren viele Schritte, sowie die Verwendung von mehreren Arten von Software. Darüber hinaus möglicherweise einige Probleme für die Richtigkeit dieser Methode beeinflussen, sind wichtig, zu erwähnen.
Die Bildqualität der in vivo MRI ist ein wichtiger Faktor. Zur Minimierung sollten die Unterschiede in der Bildauflösung zwischen MRI und digitalisierter Histologie Bilder, die kleinste mögliche MRI Voxelgröße verwendet werden. Dieses Konzept gilt auch für die Bildqualität des postmortalen MRI. Während die erhöhteAkquisitionszeit in Obduktion MRT erlaubt viel höhere Bildauflösung, kann das Präparat Bildartefakte einführen, wie fokale Signalausfälle im Zusammenhang mit Luftblasen. Diese Artefakte können Bereiche des Gewebes verdunkeln sowie dessen Kontur beeinflussen. Außerdem sind die Dimensionen des Gewebes auf der postmortalen MRI wahrscheinlich durch die Fixierungsprozess und der Dauer beeinflusst. Während die in vivo zu ex vivo kann MRI Spiel eng durch die Verwendung von anatomischen Landmarken in Schichtgeometrie Setup während der Erfassung angenähert werden, eine nichtlineare Registrierung wäre immer noch notwendig sein , ein höheres Maß an Genauigkeit zu erreichen in diesen beiden MRT – Bilder passen.
Das Design des Gehirns Halters und Slicer ist auch ein entscheidender Schritt. Beim Erzeugen des digitalen Modells des Gehirns wird ein Glättungsalgorithmus angewendet, daß das Modell relativ zur festen Gehirn leicht vergrößert. Dies ermöglicht ein leichtes Einführen des Gehirns in die Halterung und Slicer und reduziert scharfe Kanten im Halter &# 39; s Kontur. Wenn jedoch das Modell zu groß ist (beispielsweise um mehr als 5%), kann das Gehirn während der postmortalen MRI und / oder der Schnitt bewegen. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Gestaltung des Gehirns Modell anzupassen, so dass das Cerebellum richtig in die 3D-gedruckten Objekt platziert wird. Dies kann besonders schwierig sein, wenn das Kleinhirn hat während des Gehirns Extraktion bei der Autopsie beschädigt wurde.
Beim Drucken mit dem Gehirn Slicer und Halter, muss die Art der 3D-Drucker auch sorgfältig ausgewählt werden. Einige Multi-Jet-Drucker benötigen Nachbearbeitung unter Verwendung eines Ofens Trägermaterial zu entfernen. Während diese Drucker Objekte erzeugen können, die fusionierten als Deposition Modelling Desktop wasserdicht und relativ haltbarer sind (FDM) Drucker, um die Erwärmung Stützen entfernen Sie die Box leicht verziehen kann, Schaufelzwischenräume zu schaffen, die zum Gehirn Kontur nicht perfekt senkrecht stehen.
Das Gehirn sectioning Prozess ist ein weiterer entscheidender Schritt. Vor dem Schneiden the ganze Gehirn in Platten, ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Gehirn dicht im Inneren des Gehirns Slicer sitzt: Es gibt keine Bewegung sein sollte, wenn leichter Druck auf das Gehirn angewendet wird. Dadurch wird es möglich machen, die Blätter durch das Gehirn an den genauen Ort von den Ermittlern festgelegt zu schneiden. Eine kontinuierliche, ausgeglichene Druck sollte auf beide Blatthalter angewendet werden beim Schneiden. In Abhängigkeit von der Schärfe der Messer und die Steifigkeit des Gewebes, eine leichte Querschnittbewegung könnte für die Aufrechterhaltung der flachen Schnittflächen von Vorteil sein.
Das Paraffin-Einbettungsprozess kann auch eine Quelle der Fehlausrichtung zwischen den MRT und Histologie sein. Wenn die Gewebeplatte ist nicht flach gegen die Kassette während des Einbettungsprozesses sitzt, gibt es eine Neigung zwischen der Schneidebene des Mikrotoms und der Oberfläche anstelle der Platte sein. Dies wird Schneiden unbrauchbar Abschnitte erfordern eine flache Ebene zu finden, bei dem alle Gewebe ausgesetzt ist. Eine Möglichkeit für die Neigung zu korrigierenwird durch den Winkel der Betrachtungsebene auf dem hochauflösenden isotropen postmortale MRI ändern. Dies ist jedoch nahezu unmöglich, auf die in vivo MRI durchzuführen, die normalerweise mit anisotropen Auflösung (typischerweise dicke koronale Schnitte) erfasst wird.
Schließlich kann das Gewebe eine gewisse Deformation während der Periode Formalinfixierung erfahren und Paraffineinbettung (Schrumpfung), sowie bei der Herstellung von Folien (Falten, Risse, Falten). Einige dieser Verformungen kann, indem man die 4-5 & mgr; m Abschnitte in einem Wasserbad korrigiert werden, bevor auf Objektträger übertragen. Andere Verformungen können teilweise durch Ausführen einer verformbaren Bild Koregistrieren der histologischen digitalisierten Bilder auf die postmortale MRT-Bilder gelöst werden. Dennoch ist die Verformungen mit einer sorgfältigen und qualifizierten Praxis minimiert der effektivste Ansatz, um passende MRI Bände Abschnitte Histologie.
Abschließend stellte die Methodik hier ermöglicht investigators, um genau die zugrundeliegende Pathologie der MRT-Befunde zu bewerten. Allgemeiner gesagt, ist es ein vielversprechender Ansatz zur Identifizierung und / oder neuartigen Biomarker für MRI Studien validiert, die bestimmte pathologische Prozesse, wie Entzündungen oder Remyelinisierung zielen.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |