L'objectif global de ce protocole est d'aligner avec précision imagerie par résonance magnétique (IRM) des volumes d'image avec coupes histologiques par la création de supports de cerveau personnalisés 3D-imprimés et les boîtes de trancheuse.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Le protocole décrit ici permet une comparaison précise entre IRM et coupes histologiques. Le protocole est présenté dans un format unifié qui peut être appliqué sur des cerveaux humains ou de petits animaux, tels que les ouistitis ou les rongeurs. Les différences spécifiques à la grande (humaine) et petits (primate non humain et les rongeurs) cerveaux sont mis en évidence, et dans la vidéo et les figures d'accompagnement, nous démontrons l'application dans le ouistiti. Bien que la méthode est simple, le procédé nécessite de nombreuses étapes, ainsi que l'utilisation de plusieurs types de logiciels. En outre, plusieurs questions touchant potentiellement la précision de cette méthode sont importants à mentionner.
La qualité de l'IRM in vivo d'image est un facteur important. Pour réduire au minimum la disparité dans la résolution d'image entre les images IRM et histologiques digitalisés, la plus petite taille possible IRM voxel doit être utilisé. Ce concept est également valable pour la qualité de l'IRM post-mortem d'image. Alors que l'augmentationtemps d'acquisition en IRM post-mortem permet beaucoup plus haute résolution d'image, la préparation peut introduire des artefacts d'image tels que les pertes de signal focaux liés à des bulles d'air. Ces artefacts peuvent masquer les zones du tissu ainsi que affecter son contour. Par ailleurs, les dimensions du tissu à l'IRM post-mortem sont susceptibles d'être affectées par le processus de fixation et la durée. Alors que le in vivo ex vivo IRM match peut être étroitement approchée en utilisant des repères anatomiques dans la configuration de la géométrie de coupe lors de l' acquisition, un enregistrement non linéaire serait encore nécessaire pour atteindre un plus haut degré de précision dans ces deux images correspondant à l' IRM.
La conception du porte-cerveau et trancheuse est aussi une étape cruciale. Lors de la création du modèle numérique du cerveau, un algorithme de lissage est appliqué, qui élargit légèrement le modèle par rapport à la tête fixe. Ceci permet une insertion facile du cerveau dans son support et trancheuse et réduit les arêtes vives dans le support &le contour; # 39. Cependant, si le modèle est trop grand (par exemple plus de 5%), le cerveau peut se déplacer au cours de l'IRM post-mortem et / ou le sectionnement. Un autre point important est d'adapter la conception du modèle de cerveau de sorte que le cervelet est correctement placé à l'intérieur de l'objet 3D imprimé. Cela peut être particulièrement difficile lorsque le cervelet a été endommagé lors de l'extraction du cerveau à l'autopsie.
Lors de l'impression du trancheur du cerveau et le support, le type d'imprimante 3D doit également être choisi avec soin. Certaines imprimantes à jets multiples nécessitent un post-traitement à l'aide d'un four pour éliminer le matériau de support. Bien que ces imprimantes peuvent produire des objets qui sont étanches à l'eau et relativement plus durable que bureau fusionné modélisation de dépôt imprimantes (FDM), le processus de chauffage pour éliminer les supports peuvent légèrement déformer la boîte, ce qui crée des lacunes de la lame qui ne sont pas parfaitement perpendiculaire au contour du cerveau.
Le processus du cerveau sectionnant est une autre étape cruciale. Avant ème coupee cerveau entier en plaques, il est important de faire en sorte que le cerveau est assis bien à l'intérieur du trancheuse du cerveau: il devrait y avoir aucun mouvement quand une légère pression est appliquée sur le cerveau. Ainsi, il sera possible pour les lames pour couper à travers le cerveau à l'endroit précis fixé par les enquêteurs. Une pression équilibrée continue devrait être appliqué aux deux supports de lame lors de la coupe. En fonction du tranchant des lames et de la rigidité du tissu, un léger mouvement de coupe transversale pourrait être avantageux pour l'entretien de surfaces planes découpées.
Le procédé de paraffine-enrobage peut également être une source de défaut d'alignement entre l'IRM et l'histologie. Si la dalle de tissu ne siège plat contre la cassette pendant le processus d'incorporation, il y aura une inclinaison entre le plan de coupe du microtome et la place de la dalle de surface. Il faudra couper des sections inutilisables pour trouver une surface plane dans laquelle tout le tissu est exposé. Une façon de corriger l'inclinaisonest en changeant l'angle du plan d'observation sur le post-mortem IRM haute isotrope résolution. Toutefois, cela est presque impossible à réaliser sur l'IRM in vivo dans qui est généralement acquise à la résolution anisotrope (typiquement des coupes coronales d'épaisseur).
Finalement, le tissu peut subir une certaine déformation au cours de la période de fixation au formol et inclusion dans la paraffine (retrait), ainsi que lors de la préparation des lames (pliage, des fissures, des rides). Certaines de ces déformations peut être corrigée en mettant les sections 4-5 um dans un bain d'eau avant de les transférer sur des lames. D'autres déformations peuvent être partiellement résolus en effectuant l'image déformable coregistration des images numérisées histologiques aux images IRM post-mortem. Néanmoins, en minimisant les déformations à la pratique attentive et qualifiée est l'approche la plus efficace pour correspondre volumes IRM à histologie sections.
En conclusion, la méthodologie introduite ici permet investigators pour évaluer avec précision la pathologie sous-jacente des résultats de l'IRM. Plus généralement, il est une approche prometteuse pour l'identification et / ou la validation de nouveaux biomarqueurs d'IRM pour les études de recherche qui ciblent les processus pathologiques spécifiques, tels que l'inflammation ou la remyélinisation.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |