Det overordnede mål med denne protokol er at præcist at tilpasse magnetisk resonans imaging (MRI) image volumener med histologiresultater sektioner via oprettelsen af skræddersyede 3D-printet hjerne indehavere og pålægsmaskine bokse.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protokollen beskrevet her muliggør en nøjagtig sammenligning mellem MRI og histologi sektioner. Protokollen er præsenteret i en samlet format, der kan anvendes på hjerner fra mennesker eller små dyr såsom silkeaber og gnavere. Forskelle specifikke for store (menneske) og mindre (ikke-human primat og gnavere) hjerner er fremhævet, og i ledsagende video og tal, vi demonstrere anvendelsen i silkeabe. Selv om det synspunkt er ligetil, kræver fremgangsmåden mange trin samt anvendelse af flere typer af software. Desuden flere spørgsmål potentielt påvirker nøjagtigheden af denne metode er vigtige at nævne.
Billedkvaliteten af in vivo MRI er en vigtig faktor. For at minimere forskellen i billedopløsningen mellem MR og digitaliserede histologiske billeder, bør anvendes den mindst mulige MRI voxel størrelse. Dette begreb gælder også for kvaliteten af det postmortem MRI billede. Mens den øgedeerhvervelse tid i postmortem MRI tillader meget højere billedopløsning, forberedelse kan introducere billedartefakter såsom fokale signal dropouts relateret til luftbobler. Disse artefakter kan tilsløre områder af væv samt påvirke dens kontur. Endvidere er dimensionerne af vævet på obduktion MRI sandsynligvis vil blive berørt af fiksering proces og varighed. Mens in vivo til ex vivo MRI kamp kan tilnærmes ved at udnytte anatomiske landemærker i skive geometri setup under erhvervelse, ville en ikke-lineær registrering stadig være nødvendigt for at nå en højere grad af nøjagtighed i matchende disse to MRI-billeder.
Udformningen af indehaveren af hjernen og pålægsmaskine er også et afgørende skridt. Ved at skabe den digitale model af hjernen, er en udjævning algoritme anvendt denne lidt forstørrer model i forhold til den faste hjernen. Dette muliggør let indføring af hjernen i holderen og pålægsmaskine og reducerer skarpe kanter i holderen &# 39; s kontur. Men hvis modellen er for stor (fx med mere end 5%), hjernen kan bevæge sig under obduktion MR og / eller skæring. Et andet vigtigt punkt er at tilpasse designet af hjernen modellen, så cerebellum er korrekt placeret inden i 3D trykte objekt. Dette kan være særligt udfordrende, når lillehjernen er blevet beskadiget under hjernen ekstraktion ved obduktion.
Ved udskrivning hjernen pålægsmaskine og holder, skal den type 3D-printer også vælges med omhu. Nogle multi-jet printere kræver efterbehandling ved hjælp af en ovn til at fjerne støttemateriale. Mens disse printere kan producere objekter, der er vandtætte og relativt mere holdbart end desktop smeltet deposition modellering (FDM) printere, at opvarmningen fjerne understøtninger kan let slå kassen, skaber klinge huller, der ikke er helt vinkelret på hjernen kontur.
Hjernen sektionering er et andet afgørende skridt. Før skære the hele hjernen i plader, er det vigtigt at sørge for, at hjernen sidder stramt inde i hjernen pålægsmaskine: der bør være nogen bevægelse, når et let tryk påføres hjernen. Dette vil gøre det muligt for knivene til at skære gennem hjernen på det præcise sted fastsat af efterforskerne. En kontinuerlig, afbalanceret pres bør anvendes på både knivholderne når der skæres. Afhængigt af skarpheden af bladene og stivheden af væv, kunne en mindre tværgående skærebevægelse være fordelagtigt til opretholdelse af plane snitflader.
Den paraffin-embedding proces kan også være en kilde til misforholdet mellem MR og histologi. Hvis vævet plade ikke sidder fladt mod kassetten under indlejringsprocessen, vil der være en hældning mellem skæreplanet af mikrotomen og overfladen sted af pladen. Dette vil kræve at skære ubrugelige sektioner for at finde et fladt plan, i hvilket alle væv er udsat for. En måde at korrigere for tilter ved at ændre vinklen af betragtningsplanet på high-isotrope opløsning postmortem MRI. Dette er imidlertid næsten umuligt at udføre på in vivo MRI, der normalt erhverves med anisotropisk opløsning (typisk tykke koronale skiver).
Endelig kan vævet opleve nogle deformation under formalin rentebindingsperiode og paraffin indlejring (svind), samt under udarbejdelsen af dias (folde, revner, rynker). Nogle af disse deformationer kan korrigeres ved at sætte 4-5 um sektioner i et vandbad før overførsel på dias. Lign kan delvist løses ved at udføre deformerbare billede coregistration af de histologiske digitaliserede billeder til de postmortem MRI-billeder. Ikke desto mindre, minimerer deformationerne med omhyggelig og dygtig praksis er den mest effektive metode til at matche MRI volumener til histologi sektioner.
Afslutningsvis den metode indført her muliggør investigators præcist at vurdere den underliggende patologi MR-fund. Mere generelt er det en lovende metode til at identificere og / eller validere nye MRI biomarkører for forskningsundersøgelser, der er målrettet specifikke patologiske processer, såsom betændelse eller remyelinering.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |