उपयोग 3 डी प्रिंटिंग तकनीक ऊतक विज्ञान के साथ एमआरआई मर्ज करने के लिए: मस्तिष्क के लिए एक प्रोटोकॉल सेक्शनिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य सही अनुकूलित 3 डी-मुद्रित मस्तिष्क धारकों और स्लाइसर बक्से के सृजन के माध्यम से ऊतक विज्ञान वर्गों के साथ चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) छवि संस्करणों के लिए पंक्ति में है।
Abstract
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
Introduction
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित एमआरआई और ऊतक विज्ञान वर्गों के बीच एक सटीक तुलना में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल के लिए एक एकीकृत स्वरूप है कि इस तरह के marmosets या कृन्तकों के रूप में मनुष्य या छोटे जानवरों के दिमाग के लिए लागू किया जा सकता है में प्रस्तुत किया है। बड़े (मानव) के लिए विशिष्ट और छोटे (nonhuman रहनुमा और कृंतक) दिमाग डाला जाता है, और साथ वीडियो और आंकड़ों में अंतर हम एक प्रकार का बंदर में आवेदन प्रदर्शित करता है। हालांकि दृष्टिकोण स्पष्ट है, विधि कई कदम के साथ ही सॉफ्टवेयर के कई प्रकार के उपयोग की आवश्यकता है। इसके अलावा, कई मुद्दों संभवतः इस विधि की सटीकता को प्रभावित करने का उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
इन विवो एमआरआई की छवि गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण कारक है। एमआरआई और digitalized ऊतक विज्ञान छवियों के बीच छवि संकल्प में असमानता को कम करने के लिए, छोटी संभव एमआरआई voxel आकार इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस अवधारणा को भी पोस्टमार्टम के एमआरआई की छवि गुणवत्ता के लिए लागू होता है। जबकि वृद्धिपोस्टमार्टम एमआरआई में अधिग्रहण के समय में बहुत अधिक छवि संकल्प तैयारी ऐसी हवा के बुलबुले से संबंधित फोकल संकेत छोड़ने वाले बच्चों के रूप में छवि कलाकृतियों को पेश कर सकते हैं अनुमति देता है। इन कलाकृतियों ऊतक के क्षेत्रों अस्पष्ट कर सकते हैं और साथ ही अपनी समोच्च प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, पोस्टमार्टम एमआरआई पर ऊतक के आयामों के निर्धारण की प्रक्रिया और अवधि से प्रभावित होने की संभावना है। जबकि पूर्व vivo एमआरआई मैच के लिए इन विवो बारीकी अधिग्रहण के दौरान टुकड़ा ज्यामिति सेटअप में संरचनात्मक स्थलों के उपयोग के द्वारा अनुमानित किया जा सकता है, एक गैर रेखीय पंजीकरण अभी भी उन दो एमआरआई छवियों से मेल खाते में सटीकता की एक उच्च डिग्री तक पहुंचने के लिए आवश्यक होगा।
मस्तिष्क धारक और स्लाइसर की डिजाइन भी एक महत्वपूर्ण कदम है। मस्तिष्क के डिजिटल मॉडल बनाने में, एक समरेखण एल्गोरिथ्म लागू किया जाता है कि थोड़ा मायनों में इजाफा तय मस्तिष्क के लिए मॉडल रिश्तेदार। यह अपनी धारक और स्लाइसर में मस्तिष्क की आसान प्रविष्टि सक्षम बनाता है और धारक में तेज किनारों को कम करता है और# 39; s समोच्च। हालांकि, अगर मॉडल बहुत बड़ा है (उदाहरण के लिए, 5% से अधिक) के द्वारा, मस्तिष्क पोस्टमार्टम एमआरआई और / या सेक्शनिंग दौरान कदम हो सकता है। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु मस्तिष्क मॉडल के डिजाइन अनुकूलित करने के लिए इतना है कि सेरिबैलम ठीक से 3 डी मुद्रित वस्तु के अंदर रखा गया है। यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब सेरिबैलम शव परीक्षा में मस्तिष्क निकासी के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है।
मस्तिष्क स्लाइसर और धारक जब मुद्रण, 3 डी प्रिंटर के प्रकार भी ध्यान से चुना जाना चाहिए। कुछ मल्टी-जेट प्रिंटर समर्थन सामग्री को हटाने के लिए एक ओवन का उपयोग कर बाद के प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। इन प्रिंटर वस्तुओं है कि निर्विवाद और डेस्कटॉप इनकार बयान मॉडलिंग (FDM) प्रिंटर की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक टिकाऊ होते हैं उत्पादन कर सकते हैं, वहीं गर्म करने की प्रक्रिया का समर्थन करता है को दूर करने के लिए थोड़ा बॉक्स ताना कर सकते हैं, ब्लेड अंतराल है कि पूरी तरह से मस्तिष्क समोच्च को सीधा नहीं कर रहे हैं बनाने।
मस्तिष्क सेक्शनिंग प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम है। वें काटने से पहलेई स्लैब में पूरे दिमाग, यह सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क मस्तिष्क स्लाइसर अंदर कसकर बैठा है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है: कोई प्रस्ताव जब थोड़ा दबाव मस्तिष्क पर लागू किया जाता है वहाँ होना चाहिए। यह संभव ब्लेड जांचकर्ताओं द्वारा निर्धारित सटीक स्थान पर मस्तिष्क के माध्यम से कटौती करने के लिए कर देगा। जब काटने के लिए एक सतत, संतुलित दबाव दोनों ब्लेड धारकों के लिए लागू किया जाना चाहिए। ब्लेड की कुशाग्रता और ऊतकों की कठोरता के आधार पर, एक मामूली अनुप्रस्थ काटने गति फ्लैट में कटौती सतहों को बनाए रखने के लिए फायदेमंद हो सकता है।
आयल embedding प्रक्रिया भी एमआरआई और ऊतक विज्ञान के बीच misalignment का एक स्रोत हो सकता है। ऊतक स्लैब एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान कैसेट के खिलाफ फ्लैट बैठा नहीं है, तो वहाँ microtome के काटने के विमान और स्लैब की सतह जगह के बीच एक झुकाव होगा। यह व्यर्थ वर्गों को काटने एक फ्लैट विमान, जिसमें सभी ऊतक सामने आ रहा है पता लगाने के लिए की आवश्यकता होगी। एक तरीका यह झुकाव के लिए सही करने के लिएउच्च isotropic संकल्प पोस्टमार्टम एमआरआई पर देखने विमान के कोण बदलने की है। हालांकि, इस विवो एमआरआई कि आम तौर पर anisotropic संकल्प (आम तौर पर मोटी राज्याभिषेक स्लाइस) के साथ अधिग्रहण कर लिया है पर प्रदर्शन करने के लिए लगभग असंभव है।
अंत में, ऊतक, साथ ही स्लाइड (तह, खुर, झुर्रियाँ) की तैयारी के दौरान formalin निर्धारण अवधि और आयल एम्बेडिंग (संकोचन) के दौरान कुछ विरूपण अनुभव कर सकते हैं। इन विकृतियों के कुछ स्लाइड पर स्थानांतरित करने से पहले एक नहाने के पानी में 4-5 माइक्रोन वर्गों डालने से सुधारा जा सकता है। अन्य विकृतियों को आंशिक रूप से पोस्टमार्टम एमआरआई छवियों ऊतकीय डिजीटल छवियों के विरूप्य की छवि coregistration प्रदर्शन से हल किया जा सकता है। फिर भी, सावधान और कुशल अभ्यास के साथ विकृतियों को कम मात्रा में एमआरआई मिलान वर्गों ऊतक विज्ञान के लिए सबसे प्रभावी तरीका है।
अंत में, कार्यप्रणाली यहां पेश चालान में सक्षम बनाता हैestigators सही एमआरआई निष्कर्षों के अंतर्निहित विकृति का आकलन करने के लिए। आम तौर पर, यह पहचान करने और / या अनुसंधान अध्ययनों कि इस तरह की सूजन या remyelination के रूप में विशिष्ट रोग प्रक्रियाओं, लक्ष्य के लिए उपन्यास एमआरआई बायोमार्कर मान्य करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
Materials
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software | |
Referências
- Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
- ‘t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
- Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
- Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
- Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
- Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
- McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
- Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
- Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
- Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
- Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).
