Summary
Этот протокол описывает, как оценить экспрессию большого массива генов на клоновых уровне. Одноклеточный RT-КПЦР производит весьма надежные результаты с сильной чувствительностью для сотен образцов и генов.
Abstract
Экспрессия генов гетерогенность является интересной особенностью для изучения лимфоидных популяций. экспрессии генов в этих клетках изменяется в процессе активации клеток, стресса или раздражения. Выражение мультиплекс ген Одноклеточный позволяет одновременно оценку десятков генов 1, 2, 3. На уровне одноклеточных, мультиплекс экспрессия генов определяет население гетерогенность 4, 5. Это позволяет проводить различия неоднородности населения путем определения как вероятное сочетание различных стадий предшественников среди зрелых клеток, а также разнообразие ответов клетки на раздражители.
Врожденные лимфоидных клеток (ILC) были недавно описаны как совокупность врожденных эффекторы иммунного ответа 6, 7. В этом протоколе клетка гетерогенность ILC онpatic отсек исследуется в течение гомеостаза.
В настоящее время наиболее широко используемый метод для оценки экспрессии гена RT-КПЦР. Это выражение гена измеряет метод только один ген, в то время. Кроме того, этот метод не может оценить гетерогенность экспрессии генов, так как множественные клетки необходимы для одного теста. Это приводит к измерению средней экспрессии генов популяции. При оценке большого количества генов, RT-КПЦР становится по времени, reagent-, и образец затрат метод. Следовательно, компромиссы ограничить число генов или клеточных популяций, которые могут быть оценены, увеличивая риск упустить глобальную картину.
Эта рукопись описывает, как одноклеточные мультиплексной ОТ-КПЦР может быть использован для преодоления этих ограничений. Этот метод извлек выгоду из недавней микрофлюидики технологических достижений 1, 2. Реакции, происходящие в мультиплекс RT-КПЦР чипы не отлEed на nanoliter уровне. Следовательно, экспрессия генов одноклеточных, а также одновременное выражение множественный ген, может быть выполнена в reagent-, ственном образце, и экономически эффективным образом. Можно протестировать ген клеток подписи гетерогенность на клонального уровне между клеточными подмножествах в популяции на разных стадиях развития или в разных условиях , 4, 5. не Работая на редких популяций с большим числом условий на уровне одной клетки больше не является ограничением.
Introduction
За последние несколько лет, врожденные лимфоидные клетки (КМО), так как все больше и больше исследованы. Несмотря на отсутствие антиген-специфических рецепторов, они принадлежат к лимфоидного и представляют собой важные сторожей для гомеостаза тканей и воспаления. КМО в настоящее время разделены на три группы в зависимости от их экспрессии специфических комбинаций факторов транскрипции и на их способности продуцировать цитокины , 6, 7.
КМО способствуют многочисленные гомеостаза и патофизиологических ситуаций в различных органах через конкретного производства цитокина 8, 9. Для того, чтобы быть в состоянии понять роль этих клеток, важно, чтобы определить различные ILC субпопуляции за орган и определить их отношения в области развития. Кроме того, явления пластичности между различными подмножествами были связаны между собой. Изучая гетерогенностьиз клеток, присутствующих в одном органе, можно разграничить стадии их созревания и различать их специфические функции.
Чтобы проиллюстрировать технику одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР, печеночные КМО были выбраны, с особым акцентом на их неоднородности в пределах одной группы ILC (тип 1 ILC) 10. Во-первых, за счет использования проточной цитометрии, три различных ILC популяции характеризуются в печени. Группа 1 МКТ представляет около 80% врожденных эффекторов, в то время как две другие группы населения являются редкими печеночные ILC популяции (менее 5% от всех врожденных эффекторов). Эти группы населения были отсортированный с использованием широко экспрессируется клетками поверхностных маркеров ILC популяций. В результате, отсортированный ILC популяции в печени широко смотреть похожи одна на другую.
Одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР стала одним из лучших методов , чтобы оперативно расследовать разнородность этих групп населения 11
Далее, путем перебора всех клеток с глобальной ILC фенотипа, широкий обзор экспрессии нескольких генов печени ILC популяций получается, несмотря на то, что они представляют собой крайне редкие популяции. Чип Микрожидкостных на основе позволяет экспериментировать даже снебольшое количество клеточного материала. Как следствие, могут быть получены профили экспрессии генов в популяциях редких клеток. С помощью онлайн программного обеспечения для анализа генов подписи, кластеры клеточной популяции и потенциальные отношения клеток могут быть исследованы. Следовательно, функциональные тесты могут быть выполнены для проверки данных кластеризации на уровне в естественных условиях.
Десятки экспрессии генов могут быть оценены одновременно на сотни или более отдельных клеток на том же чипе 3, 11, 12. Дизайн анализа является самой длинной и самой важной частью эксперимента. Определение генов, имеющих отношение к проверяемой гипотезы имеет первостепенное значение для получения соответствующих результатов. Во-вторых, необходимы внутреннего контроля (например, известных поверхностных маркеров, используемых для сортировки) и конкретные меры контроля. Это очень важно, чтобы проверить праймера амплификации специфичность, эффективность амплификации, а Тон отсутствие конкуренции праймера. Таким образом, работа с одноклеточной мультиплексной ОТ-кПЦР является экономия времени методика, как и выражение нескольких генов клетки оценивается в то же время.
Используя тот же чип и смесь реагентов для всех ячеек ограничивает возможные ошибки манипуляций и позволяет воспроизводимости между образцами. В целом, различные аспекты одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР позволяет производить высоконадежных результатов на клонального уровне, с большим уровнем чувствительности для широкого спектра образцов и генов. Полученные результаты предлагают мощные и надежные данные для биостатистических испытаний.
Это может быть достигнуто за счет микрожидком аспекте способа, который позволяет для работы на очень малых количеств материала и приводит к исчерпывающих результатов. И, наконец, с помощью онлайн программного обеспечения, можно сравнить желательные популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом Института Пастера вопросам безопасности в соответствии с французским министерством сельского хозяйства и руководства ЕС.
1. Подготовить 96-луночного одноклеточные Сортировка плиты
- Подготовка предварительной амплификации смеси в 1,5 мл пробирку добавлением 5,0 мкл соответствующего буфера ретро-транскрипции, 1,3 мкл низкой этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) TE буфера (10 мМ раствора ТЕ, рН 8, и раствора 0,1 мМ ЭДТА; 0,2 мкМ фильтровали ), и 0,2 мкл Taq - ДНК - полимеразы на лунку (рисунок 1а).
- На 96-луночного планшета, распределить 6,5 мкл предварительно амплификации смеси в каждую лунку (до 48 скважин). Эта пластина является сортировкой пластина одноклеточного 96-луночного.
Примечание: Использование электронной пипетки рекомендуется для этого протокола. Это позволяет точные и воспроизводимые измерения объема и экономит время.
2. Single Cell диссоциация 3. Одноклеточный флуоресценция активированных сортировки клеток (FACS) 4. Предварительное усиление 5. Подготовить 96-луночного Sample Plate 6. Подготовить 96-луночный планшет для анализа 7. Одноклеточный экспрессии генов Chip 8. Запустите Чип Анализ данных 9. 
Примечание: Конечный объем в каждую лунку для образца 96-луночного планшета должно быть 9 мкл.
Примечание: При использовании широко экспрессируется ILC маркеров клеточной поверхности, 3 группы населения определяются: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + и NKp46 - IL-7Rα +. Все популяции сортируются родословие - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
Примечание: Различные типы клеток могут быть отсортированы по той же 96-луночный планшет сортировочного одноклеточного (рисунок 2).
Примечание: правильное расположение каждой клетки на пластине сортируют 96-луночного одноклеточного имеет важное значение. Компоновка плиты должны храниться на программном обеспечении с электронными таблицами. Компоновка пластина будет использоваться в течение следующих нескольких этапов (рис 1b) 14. Оставьте одну лунку, содержащую 0.2x анализа смеси и предварительной амплификации смеси на образце 96-луночного планшета без клеток. Это хорошо используется в качестве контроля не входами. Оставьте два ряда 6 лунок для кДНК разведения. Эти скважины используются в качестве контроля для эффективности праймера (Рис 1b). 
Рисунок 3: Программа предварительной амплификации. Для того чтобы иметь достаточное количество материала, предварительной амплификации специфических генов-мишеней, отсортированных одиночных клеток требуется. Сортировочный пластина одноклеточного 96-луночного загружается на амплификатор следовать программе предварительной амплификации. Продукты предварительной амплификации затем разбавляют с низким ЭДТА буфера ТЕ, и может быть использован сразу же или в замороженном состоянии при -20 ° С. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Примечание: Для того, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания праймеров, распределяют праймеры для смеси предварительной амплификации и для 96-вэйл планшету в то же время.
Примечание: Ни одна жидкость не должна быть пролита над чипом. 
Рисунок 4: Одноклеточный мультиплекс экспрессии генов чип загрузки. Эти шаги требуют грасно точность, особенно во время передачи 96-луночного планшета к одноклеточным экспрессии генов чип мультиплекса. Чтобы избежать ошибок при загрузке и misplacements, настоятельно рекомендуется работать последовательно. Объем взятый для каждой передачи должна контролироваться во время процесса пипетирования. И, наконец, важно, чтобы избежать каких-либо пузырьков и удалить их в случае образования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Примечание: "Default-10мин-Hotstart.pcl" является наиболее часто используется программа для одноклеточных мультиплекса RT-КПЦР.
& Delta ; CТ = Ct образец - внутренний контроль Ct
Сложите Изменить = 2 - (управление ΔCtsample-ΔCtnegative)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Лимфоидные популяции отображать большое разнообразие в экспрессии генов. В этом протоколе, печени МКТ отделение гетерогенность исследовали с использованием экспрессии гена RT-КПЦР одноклеточного мультиплекс. В отличие от других методов экспрессии генов, экспрессия гена RT-КПЦР одноклеточного мультиплекс позволяет работать на нескольких популяциях, даже редчайший, в то же время. Эта специфика, в сочетании с высокой чувствительностью на клоновых уровне, позволяет исследовать различия в генных подписей внутри популяции и между популяциями редких. В качестве примера, были оценены сигнатуры генов из 3 ILC популяций из печени 4-недельных мышей. Один среди населения достаточно часто, чтобы быть легко идентифицированы, в то время как два других встречаются редко (менее 1% от LINEAGE-негативных клеток) в печени.
Пластина 96-луночного одноклеточного сортировки и 96-луночного планшету были подготовлены до dissectio печенип и диссоциации (рис 1). Каждый микс был подготовлен под стерильный капотом и распределяется с электронным пипеткой для объемной точности и воспроизводимости. Все реагенты были встряхивали до того пипеткой, чтобы поддерживать гомогенность. После приготовления, пластина сортировки 96-луночный не могут быть заморожены до тех пор сортировки клеток, а также 96-луночного анализа клеток пластины не могут быть заморожены до тех пор IFC загрузки.
Печени рассекали и разбирают на одноклеточных суспензий. Клетки окрашивали и сортируют на талой 96-луночные планшеты сортировочных одноклеточных. Используя FACS, 3 ILC популяции сортировались , основанный на широко экспрессируется ILC маркеров (рисунок 2). После сортировки клеток, синтезировали кДНК и специфические гены - мишени амплифицировали (рисунок 3 и в таблице 2). После этапа предварительной амплификации кДНК разводили в буфере низкой ЭДТА TE. Праймеры и кДНК из одиночных клеток наносили на чип IFC (Fi4 и фигуры 5а). Полученные результаты (рис 7а) были упрощены для более легкого чтения и анализа (рис 7б). Примеры правильно или неправильно загруженных чипов показаны (рисунок 5). FAM фигура правильно заправлена чипа (Рисунок 6) с различными сигналами амплификации показана.
Результаты показывают , что после того, как собственно сортировки клеток, предварительной амплификации, а также нагрузки, МКТ популяция оказывается гетерогенный для экспрессии генов в печени мышей дикого типа у взрослых (рисунок 7). Используя программное обеспечение для онлайн, сигнатуры экспрессии генов клеток специфических (7 и 8) и отношения клеточной популяции (рисунок 8) могут быть идентифицированы. Каждая отсортирован популяция имеет определенный ген подпись, обогащенную экспрессии генов. Например, клетки сортировались как NKp46 - IL-7Rα + имеем еnriched экспрессия RORC, основного фактора транскрипции группы 3 КМО; Rora, A RORC фактор -homologous транскрипции; и ИЛ-23R и CXCR6, два важных рецепторов группы 3 ILC печеночных маркеров в печени. Те же наблюдения могут быть сделаны с NKp46 + IL-7Rα - и NKp46 + IL-7Rα + популяции. Каждая клетка проверяется на наличие экспрессии генов домашнего хозяйства (HPRT, Act и GAPDH) , чтобы исключить недопустимые скважин; по крайней мере, два гена домашнего хозяйства должны быть выражены рассматривать значения действительными.
Интересно отметить , что эта методика позволяет для определения двух субпопуляций NKp46 + IL-7Rα - на основе сигнатур генов. Различия между этими двумя подписями должны быть подтверждено другими наборами различных функциональных экспериментов.
![фигура 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Рисунок 2: стратегия FACS клеток. Изображения являются репрезентативными изолированных клеток печени от 4-недельных мышей. (А) FSC-A / SSC-стробирования, (б) FSC-H / FSC-W дискриминация дублет, (в, г, е) живой, родословная-отрицательных CD45.2 + CD4 - CD3 - клетки стробирования. (Е) Используя широко экспрессируется ILC маркеры клеточной поверхности, мы определили 3 группы населения: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + и NKp46 - IL-7Rα +. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: цифры ROX из правильно (а) И неправильно (б) загружены чипы. (А) правильно заправлена одноклеточного мультиплекс экспрессии генов чип должен появиться с прямыми линиями и строк. Каждая реакционная камера заполнена и имеет ту же размерность. (Б) неправомерное загружен одноклеточного мультиплекс экспрессии генов чипа. Пустые строки и строки реакционных камер появляются (зеленый квадрат), а также линии сгиба (синий квадрат). Эти функции могут быть из-за неправильной "PRIME" или "Load" шагов, а также остаточных пузырьков в МФК скважинах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: FAM (Флюоресцеиновая амидита) фигура правильно заправлена чипа. После нескольких циклов (в зависимости от образцов и на грунтовку ы оценивали), должны появиться различия в реакционной камере яркости. Реакционные камеры с сигналом усиления должен выглядеть ярче (синий квадрат), чем реакционные камеры с отсутствием или низким сигналов амплификации (зеленый квадрат). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Теплокарта полученные до (а) и после (б) модификаций. (А) Прямая Тепловая карта получена без анализа или модификации порядка анализа / образца. (Б) Модифицированная Тепловая карта , полученная после образца и анализа определения имен. Нет входных скважин (синий квадрат) не будут получены, если не происходит усиления. Неэффективные праймеры (зеленый квадрат). Испытание кДНК разведения (фиолетовый квадрат). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: Одноклеточный популяция кластеризация. Программное обеспечение для анализа данных используется для определения кластеризацию между популяциями. Свободное программное обеспечение кластеризации доступны в Интернете. Оценивая весь профиль экспрессии одной ячейки, программное обеспечение может отображать подписи генов и отношения клеточной популяции. Каждый квадрат представляет собой ячейку: синий являются NKp46 + IL-7Rα - цвет , красный цвет NKp46 + IL-7Rα +, и зеленый NKp46- IL-7Rα +. Каждая популяция имеет определенный ген подпись. В NKp46 + IL-7Rα - населения, две подписи можно увидеть, что свидетельствует о неоднородности населения.4858 / 54858fig8large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Грунтовки | |
| Actb | Ил-23R |
| Айз | Ил-2га |
| Ahr | Ил-2RB |
| Bcl2 | II-7ra |
| с-Мус | Klr5 |
| Cbfb | Lef1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| CXCR6 | Rora |
| Eomes | RORC |
| Ets1 | Runx3 |
| foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| Gata3 | Tcf7 |
| ГМ-КСФ | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| HPRT | Tsc22d3 |
| Id2 | Tnfrsf11a |
| Ил-12rb2 | Tox |
| Ил-18r1 | Zbtb16 |
| Ил-1rl1 | Zbtb7b |
| Ил-22 | |
Таблица 1: Праймер список.
Таблица 2: Программа предварительной амплификации. Каждый шаг программы предварительной амплификации показана с полной информацией о времени, температуры и количества циклов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, как получить исчерпывающую информацию экспрессии генов на уровне клонального. Здесь мы исследовали печени ILC отделения гетерогенность. После сортировки одноклеточного различных ILC популяций (на основе широко экспрессируется ILC поверхностных маркеров), образцы были предварительно усиливается для конкретных предварительно выбранных генов. Затем полученную кДНК и праймеры были загружены на мультиплексной RT-КПЦР микрожидком чипа. И, наконец, мы получили выражение 48 различных генов из 48 отдельных клеток. Результаты экспрессии генов были проанализированы с помощью онлайн программного обеспечения для изучения генов подписи и клеточной популяции отношения.
Основным преимуществом этого метода является возможность оценить несколько экспрессии генов одновременно. Она также позволяет работать на клоновых уровне и в очень редких популяций. В отличие от традиционных методов RT-КПЦР, одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР не имеет никакого усреднения эффекта, так как экспрессия генов оценивается на уровне клонального. таким образом, Гетерогенность в пределах популяции могут быть обнаружены и проанализированы. Одноклеточный выражение RT-КПЦР позволяет работать в очень редких популяций, так как нужны только очень немногие клетки, чтобы получить широкую информацию о экспрессии генов. Кроме того, разные популяции клеток могут быть испытаны на том же планшете. Это позволяет выявлять различия в генной подписи между популяциями и, с онлайн-инструментов, данных, оценки отношений клеточной популяции. Эта методика представляет другие преимущества. Одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР имеет преимущество последних достижений микрофлюидальных. Объемы, необходимые в камерах МФК не превышают nanoliter уровня. Таким образом, используются более низкие количества реагентов, снижая стоимость экспериментов. И, наконец, общее количество шагов при использовании пипеток снижается, ограничивая тем самым возможность возникновения ошибок при использовании пипеток. Шаги одновременны для всех клеток и может быть сделано с помощью многоканальной пипетки, что позволяет работать быстро и экономии времени образом. Полученные результаты вКлональная уровня являются воспроизводимыми, надежными и могут быть использованы для выполнения надежной анализа данных.
Одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР, тем не менее, приведем некоторые ограничения. Во-первых, этот метод требует дорогостоящего и специального оборудования, такого как микрожидком чип, микрожидком контроллер чипа, а также конкретного амплификатора. В отличие от традиционных методов RT-КПЦР, этот метод требует больших затрат времени и реагент экономии, так как, с обычным RT-кПЦР, необходимы многочисленные исследования для получения статистически значимых сравнений. В этом протоколе, мы представляем процедуру получения экспрессии генов 48 генов. 96-96 мультиплекс RT-КПЦР микрофлюидальные чипы доступны. Эти чипы могут оценить экспрессию генов в течение 96 генов из 96 клеток, в то же время. Во время сортировки клеток, минимальное количество исходных клеток необходимы, так как точность и чистота ячейка должна быть максимальной. Тем не менее, даже при небольшом количестве клеток, по-прежнему можно сортировать по одноклеточного мультиплексной ОТ-КПЦР гена ехрression (этап 3). Наконец, одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР является чувствительным методом. Различные тесты должны быть выполнены перед началом подобных экспериментов. Например, для целевой праймер специфичности, праймеры должны быть проверены на эффективности амплификации и относительной конкуренции за цели.
Несколько шагов протокола должны выполняться с осторожностью. Манипуляции малых объемов в сочетании с большим количеством проб и анализов, в то же время увеличивает риск ошибок при использовании пипеток (шаги 1, 4, 5, 6, и 7). Все реагенты и смеси следует перемешать до пипеткой с целью обеспечения однородного раствора. Испарение при предварительной амплификации (этап 4) может также повлиять на окончательные результаты. Пластины всегда должны быть надлежащим образом герметизируются с использованием соответствующей защитной пленки. Сортировка стратегии должно быть очень точным (шаг 3), чтобы избежать мертвых клеток или несколько ячеек в скважинах внутри пластин. FACS сортировочные машины теперь оснащены сортировочного одноклеточного Indех программное обеспечение, которое может записывать какие конкретные ячейки были отсортированы в каждую лунку. Этот новый инструмент будет представлять интерес для определения является ли подписи генов коррелируют с интенсивностью клеточной поверхности маркера. Примеры и анализа положения на чипах должны быть организованы тщательно, так как это имеет важное значение для эксперимента (шаги 1, 5 и 6). И, наконец, выбор праймеров (шаг 1 и 6), является важным шагом. Каждый праймер должен быть выбран на основании описанных выше результатов или ожидаемых результатов. Случайный выбор праймеров в наборе оцениваемых генов может ухудшить окончательный отсчет эксперимента. Кроме того, праймеры, которые коррелируют с клеточной поверхности маркер, используемый для сортировки клеток должны быть использованы в качестве контрольных с генов домашнего хозяйства.
Оценка мультиплекс экспрессию генов на уровне клонального обеспечивает лучшую характеристику печени ILC гетерогенной отделения, чем в предыдущих исследованиях. Этот метод, поставляется программное обеспечение для онлайн, описывает более точно Different подмножества ILC в печени при гомеостаза, чем исследования с использованием только маркеры клеточной поверхности. Кроме того, можно рассмотреть отношения клеточной популяцией и строить дифференциации сетей. Подписи генов, основанные на экспрессии генов одноклеточных, также являются важными инструментами усмотреть черты клеточной популяции и изучить потенциальные роли. Одноклеточный мультиплексной ОТ-КПЦР является одним из лучших методов для анализа экспрессии генов, чтобы получить достоверные данные. Эти данные могут быть легко управляемы с биоинформатики программного обеспечения 15. Что касается других методов исследований экспрессии генов, таких как микрочипы или РНК последовательности, одноклеточный мультиплекс RT-КПЦР обладает высокой чувствительностью. Другие подходы к анализу одноклеточных были описаны и могут быть использованы в качестве дополнительных методов для одноклеточного мультиплексной ОТ-кПЦР 15, 16. Кроме того, этот метод может быть выполнена с любой комбинацией праймера, allowinпользователи г смотреть на персонализированных подписей генов. Многие другие приложения могут быть использованы с этой техникой. Например, экспрессия гена временной ход клеток на протяжении развития может быть сделано для оценки изменения молекулярного профиля в процессе разработки. Эффекты препарата на клетки также могут быть исследованы с разбавлением препарата для определения порога эффективности лекарственного средства на экспрессию генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
