检查蛋白酶体大会与重组古菌蛋白酶体和非变性PAGE：该案例相结合的办法
Summary
该协议使用两个亚基共表达和postlysis亚基重组蛋白酶组件的更彻底的检查混合。
Abstract
蛋白酶在生活的各个领域中。它们提供了细胞内的蛋白质分解的真核生物的主要途径，尽管它们的装配是不完全理解。所有蛋白酶含有一个结构上保守的芯颗粒（CP）或20S蛋白酶，含有夹在两个七聚体α亚基环之间的两个七聚体β亚基环。相比，他们的真核同行古20S蛋白酶体在成分简单，但他们都有着共同的组装机理。因此，古细菌20S的蛋白酶体继续是真核蛋白酶体组件重要的模型。具体来说，再加上非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）古20S蛋白酶体的重组表达已经取得了许多重要见解蛋白酶体生物合成。在这里，我们讨论来改善古蛋白酶体α的共表达通常的战略手段和nondenaturiβ亚基前NG PAGE。我们表明，虽然快速，高效，单独共表达的方式可能会错过关键总成的中间体。在蛋白酶体中的情况下，共表达可能不允许检测半蛋白酶体，中间包含一个完整的α型环和一个完整的β型环。然而，该中间体易于通过裂解物混合进行检测。我们建议用裂解液混合相结合共同表达产生一种方法，是在分析装配更彻底，但仍然劳动nonintensive。这种方法可以用于其它重组多蛋白复合物的研究是有用的。
Introduction
多蛋白复合开展众多关键的细胞活动1。对于许多这些配合物，进一步被知道关于其结构和功能大于约他们的组件2,3。蛋白酶体就是这样的一个复杂的，在生活的各个领域中找到。在真核生物中，这种分子机是在泛素/蛋白酶体系统（UPS）的核心，并提供了细胞内蛋白质的降解4的主要途径。真核蛋白酶体（简称为26S蛋白酶体）包括两个主要的子组件：一个20S蛋白酶，或核颗粒（CP）的5，可以在通过一个19S调节颗粒（RP）6的一端或两端封端。
20S蛋白酶是一个大的条块蛋白酶。其四级结构跨越所有生活领域绝对保守和由含有两种类型的结构上相关的亚基四七元环的栈，α;和β5,7,8。在真核生物中，这两个外圈各自包括的七个不同的α亚基和两个内环各自包括的七个不同的β亚基;蛋白水解活性驻留三个β亚基的范围内。相比之下，古细菌和细菌的CP环通常仅包括一种类型的α和一种类型的β亚基组成。古菌蛋白酶提供了一个重要的模型系统来研究蛋白酶体装配，由于双方的成分简单，他们与真核同行9-13共享一个共同的组装机理。简言之，α亚基组装成α环第一，它作为其上β亚基组装的支架。所得半蛋白酶（α7β7）二聚化，从而产生完全组装的CP（α7β7β7α7）。在二聚化，前肽提出关于β亚基被自催化除去，露出催化N-末端苏氨酸。利用古蛋白酶体模型组装经常需要生产中大肠杆菌重组古蛋白酶蛋白质的优势。这是一个值得的方法，因为它使在不同的组合要生产的亚单位，因为WT和突变的版本中，在不产生其自身的蛋白酶的宿主生物体。
监测多蛋白质复合物的装配生化需要某种用于分隔组件的中间体和前体的完全组装络合物分馏方法。由于其优越的解决容量，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）已被证明是在各种大型多蛋白复合物14-17的分馏特别有用。重组古蛋白酶生产和非变性PAGE的结合已成为一个dissectin强大的方法摹蛋白酶装配9,11,12,18。然而，通过此方法应用于（ 即通过α和β亚基的重组共表达）通常的方法有一个重要的缺点。大会的反应是合作，并强烈浓度依赖性3。鉴于在细胞内的蛋白质浓度是非常高的19中 ，由于排除体积效果，装配反应在体内迅速进行。因此，它有可能错过重要组件中间体当α和β亚基同时表达。
在这里，我们主张用重组古蛋白酶体亚基组装蛋白酶的研究组合的方法。在这种方法中，采用两个共表达和溶胞产物混合方法。前者允许组装的快速分析，因为共同表达是低劳动强度。后者取决于α和β亚基，接着混合的分开的表达。虽然这requi水库比共表达多一点努力，其大于补偿用于通过检测被共表达时错过中间体的能力。总之，这两个方法可以提供蛋白酶组件的更全面的了解。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们展示相结合的办法的好处通过重组古蛋白酶非变性PAGE分析蛋白酶体装配。蛋白酶体亚基的细菌共表达的常用方法9,11允许快速分析，但可能不露出键组件的中间体。我们建议用裂解液共表达相结合的混合开发汇编事件更宽阔的视野。
这种结合方法的优点是，尽管要求的α分开的表达和β亚基为裂解物混合，它仍然是相对劳动友好。结果也可以是半定量如果确保了单…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是部分来自印第安纳大学 – 普渡大学印第安纳波利斯研究扶持资金补助（RSFG），部分由美国心脏协会14GRNT20390154奖，支持ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
Referências
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