組換え古細菌プロテアソームおよび非変性PAGEでプロテアソームアセンブリを調べる：複合的アプローチのためのケースを
Summary
このプロトコルは、サブユニットの同時発現および組換えプロテアソームアセンブリのより完全な検査のために混合postlysisサブユニットの両方を使用しています。
Abstract
プロテアソームは、人生のすべてのドメインで発見されています。そのアセンブリが完全に理解されていないけれども彼らは、真核生物では細胞内タンパク質分解の主要な経路を提供します。すべてのプロテアソームは、構造的に保存されたコア粒子（CP）を含む、または20Sプロテアソーム二七量体αサブユニットのリング間に挟まれた2つの七量体のβサブユニットの環を含みます。古細菌の20Sプロテアソームは、彼らの真核生物の対応物と比較して、組成単純であり、まだ彼らの両方が共通の組立機構を共有しています。その結果、古細菌の20Sプロテアソームは、真核生物のプロテアソームのアセンブリのための重要なモデルであり続けます。具体的には、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いて結合された古細菌の20Sプロテアソームの組換え発現は、プロテアソーム生合成に多くの重要な洞察をもたらしました。ここでは、nondenaturi前に古細菌のプロテアソームのαおよびβサブユニットの共発現の通常の戦略を改善するための手段を議論しますngのPAGE。我々は、迅速かつ効率的なものの、単独で共発現アプローチはキーアセンブリ中間体を逃すことができることを示しています。プロテアソームの場合には、共発現は、一つの完全なα-リングと一つの完全なβ-リングを含む中間のハーフプロテアソームの検出を許可しない場合があります。しかし、この中間体は、容易に溶解物混合を介して検出されます。私たちは、溶解液の混合と共発現を組み合わせることアセンブリを分析する上で、より徹底したアプローチをもたらす、まだ労働nonintensiveままであることを示唆しています。このアプローチは、他の組み換え多タンパク質複合体の研究に有用であり得ます。
Introduction
多タンパク質複合体は、1多数の重要な細胞活動を行っています。これらの複合体の多くは、はるかに彼らのアセンブリ2,3についてよりも、構造と機能について知られています。プロテアソームは、そのような複雑であり、人生のすべてのドメインに含まれています。真核生物では、この分子機械は、ユビキチン/プロテアソームシステム（UPS）の中核であり、細胞内タンパク質分解4の主要な経路を提供します。 19S調節粒子（RP）6によって一方または両方の端部に蓋をすることができ20Sプロテアソーム、またはコア粒子（CP）5、（26Sプロテアソームと呼ばれる）、真核生物のプロテアソームは、二つの主要なサブアセンブリで構成されています。
20Sプロテアソームは、大区画化プロテアーゼです。その四次構造は、絶対に人生のすべてのドメインにわたって保存されており、構造的に関連したサブユニットの2つのタイプを含む4〜7員環のスタックで構成され、α;そして、5,7,8、β。真核生物では、二つの外側リングはそれぞれ7別個のαサブユニットから構成され、2つの内輪は、それぞれ7個別のβサブユニットから構成されています。タンパク質分解活性は、βサブユニットの3内に存在します。対照的に、古細菌のCPリングは、通常、αの唯一の種類及びβサブユニットの一種で構成されています。古細菌のプロテアソームは、その組成の単純さと彼らのが彼らの真核生物のカウンターパート9-13と共通の組立機構を共有の両方にプロテアソームアセンブリを研究するための重要なモデルシステムを提供しています。簡単に言えば、αサブユニットは、βサブユニットが集合し、その上に足場として機能する、最初のαリングに集合します。完全に組み立てられたCP（α7β7β7α7）を生じさせる結果のハーフプロテアソーム（α7β7）二量体化、。二量体化の間にβサブユニットに、プロペプチドが存在自己触媒触媒N末端スレオニンを露出、除去されます。アセンブリをモデル化するために古細菌プロテアソームの使用は、しばしば、大腸菌における組換え古細菌プロテアソームタンパク質の産生を利用します。それは自身のプロテアソームを産生しない宿主生物において、WT及び変異型の両方の、種々の組み合わせで製造されるサブユニットを可能にするので、これは価値のあるアプローチです。
多タンパク質複合体の集合を監視することが生化学的に組み立て中間体および前駆体から完全に組み立てられた複合体を分離分別方法のいくつかの種類を必要とします。その優れた解決能力に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を非変性することは、様々な大規模な多タンパク質複合体14-17の分別に特に有用であることが証明されています。組換え古細菌のプロテアソームの生産と非変性PAGEの組み合わせはdissectinに強力なアプローチとなっていますグラムプロテアソームアセンブリ9,11,12,18。しかし、このアプローチが適用される（ すなわち 、α及びβサブユニットの組換え共発現を介して）通常の方法は重大な欠点を有しています。アセンブリ反応は、協同組合と強く濃度依存性の3です。細胞内部のタンパク質濃度は、アセンブリ反応は、インビボで急速に進んで、排除体積効果により、19非常に高いことを考えます。したがって、αおよびβサブユニットが同時発現させる際に重要なアセンブリ中間体を欠場することが可能です。
ここでは、組換え古細菌のプロテアソームサブユニットを使用して、プロテアソームアセンブリの研究に合わせたアプローチを主張しています。このアプローチでは、両方の同時発現と溶解液の混合方法が使用されます。共発現が少ない労働集約的であるため、前者はアセンブリの迅速な分析を可能にします。後者は、混合したαおよびβサブユニットの別々の発現に依存します。このrequiがけれども共発現よりも解像度もう少し努力が、それは同時発現の際に失われる中間体を検出する能力によって補償以上のものです。一緒に、これらの2つの方法は、プロテアソームのアセンブリのより完全な像を提供することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、組換え古細菌のプロテアソームを使用してページを非変性することによりプロテアソームアセンブリを分析する組み合わせアプローチの利点を実証します。プロテアソームサブユニットの細菌共発現する通常の方法9,11は、迅速な分析を可能にしますが、キーアセンブリ中間体を明らかにしないことがあります。私たちは、アセンブリイベントの広い画像を開発するために?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はARKに、米国心臓協会14GRNT20390154からの受賞によって、部分的にはインディアナ大学 – パデュー大学、インディアナポリスからの研究支援基金助成金（RSFG）によって部分的にサポートされていました
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
Referências
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