Examiner Assemblée protéasome avec recombinant Archaeal Protéasomes et dénaturant PAGE: le cas pour une approche combinée
Summary
Ce protocole utilise à la fois sous-unité coexpression et sous-unité postlysis mélange pour un examen plus approfondi de l'ensemble de protéasome recombinant.
Abstract
Protéasomes se trouvent dans tous les domaines de la vie. Ils fournissent la principale voie de dégradation intracellulaire des protéines chez les eucaryotes, bien que leur montage ne soit pas complètement compris. Tous les protéasomes contiennent une particule de noyau structurellement conservée (CP), ou le protéasome 20S, contenant deux sous-unités ß des anneaux de heptamériques pris en sandwich entre deux anneaux de sous-unités α heptamériques. Archaea 20S protéasomes ont une composition plus simple par rapport à leurs homologues eucaryotes, mais ils partagent tous deux un mécanisme d'assemblage commun. Par conséquent, 20S archées proteasomes continuent à être des modèles importants pour l'assemblage du protéasome eucaryote. Plus précisément, l'expression recombinante de 20S archées proteasomes couplée à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (PAGE) a donné de nombreuses informations sur protéasome biogenèse. Ici, nous discutons un moyen d'améliorer la stratégie habituelle de coexpression des archées protéasome α et sous-unités ß avant nondenaturing PAGE. Nous démontrons que, bien que rapide et efficace, une approche de coexpression seul peut manquer des intermédiaires d'assemblage clés. Dans le cas du protéasome, coexpression peut ne pas permettre la détection de la demi-protéasome, un contenant un α-anneau complet intermédiaire et un β-anneau complet. Cependant, cet intermédiaire est facilement détectée par lysat mélange. Nous suggérons que la combinaison coexpression avec lysat mélange donne une approche plus approfondie dans l'analyse de l'assemblage, mais il reste encore du travail non intensif. Cette approche peut être utile pour l'étude d'autres complexes multiprotéiques recombinantes.
Introduction
Complexes multiprotéiques effectuent de nombreuses activités cellulaires critiques 1. Pour beaucoup de ces complexes, beaucoup plus on connaît leur structure et leur fonction que de leur assemblage 2,3. Le protéasome est un tel complexe et se retrouve dans tous les domaines de la vie. Chez les eucaryotes, cette machine moléculaire est au cœur du système protéasome / Ubiquitin (UPS) et fournit la principale voie de dégradation des protéines intracellulaires 4. Le protéasome eucaryote (dénommé protéasome 26S) est composé de deux ensembles principaux sous: un protéasome 20S, ou Core particules (CP) 5, qui peut être coiffé sur une ou deux extrémités par une particule réglementaire 19S (RP) 6.
Le protéasome 20S est une grande protéase compartimentée. Sa structure quaternaire est complètement conservée dans tous les domaines de la vie et se compose d'un empilement de quatre cycles à sept chaînons contenant au moins deux types de sous-unités de structure apparentée, α; et ß 5,7,8. Chez les eucaryotes, les deux bagues extérieures sont chacune composées de sept sous-unités a différentes et les deux bagues intérieures sont constitués chacun de sept sous-unités ß distinctes; une activité protéolytique réside dans trois des sous-unités ß. En revanche, les anneaux de CP de archéobactéries et des bactéries sont habituellement constituées d'un seul type de α et une sous-unité β type. Proteasomes Archaea ont fourni un important système modèle pour étudier l' assemblage du protéasome due à la fois à leur simplicité de composition et de leur partager un mécanisme d'assemblage commun avec leurs homologues eucaryotes 9-13. En bref, les sous-unités alpha assemblent en anneaux d'a d'abord, qui servent comme un échafaudage sur lequel ß sous-unités se rassemblent. Les demi-protéasomes résultant (α 7 β 7) dimériser, donnant lieu à des entièrement assemblés CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Au cours de la dimérisation, les propeptides présents sur les sous-unités ßsont enlevées par voie autocatalytique, ce qui expose les thréonines catalytique N-terminal. L'utilisation des protéasomes archéobactéries pour modéliser l' assemblage prend souvent l' avantage de la production de protéines recombinantes dans protéasome archéobactéries Escherichia coli. Cette approche est utile, car elle permet aux sous-unités à produire dans diverses combinaisons, à la fois comme WT et versions mutantes, dans un organisme hôte qui ne produit pas ses propres protéasomes.
Contrôle de l'assemblage des complexes multi-protéiques nécessite biochimiquement une sorte de méthode de fractionnement qui sépare les complexes entièrement assemblés à partir des intermédiaires d'assemblage et de précurseurs. En raison de sa capacité de résoudre supérieure, non dénaturant sur gel de polyacrylamide L' électrophorèse (PAGE) est avéré être particulièrement utile pour le fractionnement de divers grands complexes multiprotéiques 14-17. La combinaison de la production de protéasome Archaea recombinant et PAGE dénaturant est devenue une approche puissante en dissecting assemblage de protéasome 9,11,12,18. Cependant, la méthode habituelle par laquelle cette approche est appliquée ( par exemple. Par la co – expression recombinante de sous – unités a et ß) présente un inconvénient important. Les réactions de l' Assemblée sont coopératifs et fortement dépendante de la concentration 3. Étant donné que la concentration de la protéine dans les cellules est très élevée 19, en raison des effets de volume exclu, les réactions d'assemblage se déroulent rapidement in vivo. Il est donc possible de manquer des intermédiaires d'assemblage importants lorsque a et ß sous-unités sont coexprimaient.
Ici, nous plaidons pour une approche combinée à l'étude de l'ensemble de protéasome en utilisant des sous-unités du protéasome archées recombinantes. Dans cette approche, les deux méthodes de mélange coexpression et lysat sont utilisés. La première permet une analyse rapide de l'ensemble parce coexpression est moins de travail. Celle-ci dépend de l'expression séparée des sous-unités a et ß, suivi par le mélange. Bien que ce requires un peu plus d'effort que coexpression, il est plus que compensée par la capacité à détecter les intermédiaires qui sont manqués pendant coexpression. Ensemble, ces deux méthodes peuvent fournir une image plus complète de l'ensemble de protéasome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous démontrons au profit d'une approche combinée à l'analyse de l'assemblage du protéasome par dénaturants PAGE en utilisant proteasomes archées recombinantes. La méthode habituelle 9,11 de coexpression bactérienne des sous – unités du protéasome permet une analyse rapide , mais peut ne pas révéler des intermédiaires d'assemblage clés. Nous vous suggérons de combiner coexpression avec lysat de mélange pour développer une image plus large des événements de l'Assemblée. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par un soutien des fonds de subvention de la recherche (RSFG) de l'Indiana University-Purdue, Indianapolis, et en partie par un prix de l'American Heart Association 14GRNT20390154, à ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
Referências
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