化学発光法を用いて、生物学的材料に、一酸化窒素経路に亜硝酸塩と硝酸塩、代謝物を測定します
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
一酸化窒素（NO）は、血管の恒常性とも神経伝達物質の主要な調節因子分子の一つです。酵素的に生成NOは、様々なオキシヘムタンパク質および他のまだあまり知られていない経路との相互作用によって亜硝酸塩と硝酸塩に酸化されます。逆のプロセス、NOへの亜硝酸塩と硝酸塩の減少は10年で、哺乳類で発見されていた、あると考えられている心血管、代謝と筋肉の障害の全範囲を防止または緩和するのいずれかの可能な経路の一つとして注目を集めていますNOレベルの低下に関連すること。血液、体液、および様々な組織 – 異なる身体区画にNO及びその代謝産物の量を推定することが重要です。その簡単なアクセシビリティのために血液は、NO代謝物の推定のために使用される好ましいコンパートメントです。その寿命が短い（数ミリ秒）および低サブナノモル濃度、血液のNOの直接の信頼性の高い測定のために<em>の生体内存在の偉大な技術的困難インチしたがって、NO可用性は、通常、その酸化物、亜硝酸塩と硝酸塩の量に基づいて推定されていません。これら二つの代謝産物は、常に別々に測定されています。生物学的液体および組織におけるそれらの濃度を決定するためのいくつかの十分に確立された方法があります。ここでは、それぞれ、三ヨウ化物またはバナジウム（III）塩化物溶液によって亜硝酸塩や硝酸塩還元後にNOの分光光度検出に基づいて、化学発光法（CL）のためのプロトコルを提示します。亜硝酸塩と硝酸塩の検出感度はNO代謝経路の変化を決定するために現在利用可能な最も感度の高い方法としてCLを設定し、低ナノモル範囲です。私たちは、サンプル中のそれぞれの量を決定するために収集し、どの時点で亜硝酸塩と硝酸塩の存在の元の量を維持するために、生物学的流体および組織からのサンプルを調製する方法を詳細に説明します。 CL技術の限界もEXPありますlained。
Introduction
亜硝酸塩、およびより少ない硝酸塩を拡張するために、血液中の濃度は、身体の全体的な状態のNO代謝を反映していません。亜硝酸塩の血液中の濃度は、ほとんどの臓器や組織は、高ナノモルまたは低マイクロモルの範囲であるだけで、硝酸塩は、通常、はるかに高い量で存在する – マイクロモルの範囲内で。亜硝酸塩の疾患の進行に起因するレベルまたは食習慣の変化の変化は非常に小さく、非常に感度の高い方法を用いて測定することができます。そのため、それらの非常に異なるレベルと異なる代謝過程で、亜硝酸塩と硝酸塩のレベルの独立した決意が不可欠です。亜硝酸塩と硝酸塩が一緒に測定されている」 の NO x決意」いわゆるませんが、非常に小さな値となっています。
種々の生物学的試料中の亜硝酸塩を定量化するためのいくつかの方法が開発されている – 最も一般的には元々あっても現代modificatioと1879年に記載されたグリース反応に基づいて、最も古いものですNS、グリース」の方法によって達成亜硝酸塩のための感度限界は、低マイクロモルの範囲です。三ヨウ化物還元溶液と組み合わせた化学発光（CL）は、現在、亜硝酸塩濃度1-8,10,11の低いナノモル範囲の定量化を可能にする、最も敏感な方法であると考えられています。溶液を還元バナジウム（III）塩化物と組み合わされ、同じCL法は、ナノモル範囲9の精度と、硝酸塩の敏感な測定のために使用することができます。
CLは、遊離ガスのNOを検出します。従って、亜硝酸塩、硝酸塩、Rニトロソチオール（R-SNO）、R-ニトロソアミン（R-NNO）、または金属-NO化合物（後の原稿の「R-（X）-NO」と称する）に変換されなければなりませんCLを介して元の量を定量化するために、NOガスを解放しません。 NOへの変換は、NO代謝物の性質に応じて、いくつかの異なる還元性溶液を用いて達成されます。変換後、遊離NOガスは、キャリアガス（彼は、Nによって反応容器からパージされていませんオゾン（O 3）（NO 2）その活性化状態で二酸化窒素を形成するために、NOと組み合わされCL分析装置の反応チャンバ内に2またはAr）。基底状態に戻ると、NO 2が *赤外領域で発光し、放出された光子は、CL装置の光電子増倍管（PMT）によって検出されます。放出される光の強度は、適切な較正曲線を使用して、元の種の濃度の計算を可能にする反応チャンバ内のNO濃度に正比例します。
我々のプロトコルでは、我々最も使用される臨床現場における亜硝酸塩と硝酸塩の最初の存在CLベースの決意 – 血液および血漿中、およびその後、我々は、組織試料中のこれらのイオンを決定する方法について説明します。我々はまた、血液やそのコンパートメント、血漿および赤血球などの亜硝酸塩反応性環境でオリジナルの生理的亜硝酸塩濃度を維持する方法を詳細に説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップ
オリジナルサンプルを調製希釈又は他の方法で治療するために使用される（水を含む）全ての溶液のアリコートを保存する必要があり、可能な亜硝酸または（より頻繁に）硝酸塩汚染を確認しました。私たちは、最も汚染が水から来て、多くの化学物質はまた、内因性の硝酸決意を妨害するいくつかのロットでの硝酸塩汚染のかなりの量が含…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、血液中の亜硝酸塩の測定のための亜硝酸塩保存液の使用の開発に博士A. DejamとMMペルティエの重要な貢献を承諾します。
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
Referências
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