La medición de nitritos y nitratos, los metabolitos en el Oxido Nítrico, en Materiales Biológicos utilizando el método de quimioluminiscencia
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
El óxido nítrico (NO) es una de las principales moléculas de regulador en la homeostasis vascular y también un neurotransmisor. producido enzimáticamente NO se oxida en nitrito y nitrato por interacciones con diversas proteínas oxi-hemo y otras vías todavía no bien conocidas. El proceso inverso, la reducción de nitrito y nitrato en NO había sido descubierto en mamíferos en la última década y que se destaca por ser una de las posibles vías para prevenir o aliviar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares, metabólicas y trastornos musculares que se cree estar asociado con niveles disminuidos de NO. Por tanto, es importante para estimar la cantidad de NO y sus metabolitos en diferentes compartimentos del cuerpo – la sangre, fluidos corporales y los diversos tejidos. La sangre, debido a su fácil accesibilidad, es el compartimiento preferido utilizado para la estimación de metabolitos de NO. Debido a su corta vida (pocos milisegundos) y baja concentración sub-nanomolar, mediciones fiables directas de sangre NO <em> in vivo presentan grandes dificultades técnicas. Por lo tanto la disponibilidad de NO se estima por lo general basado en la cantidad de sus productos de oxidación, nitrito y nitrato. Estos dos metabolitos siempre se miden por separado. Hay varios métodos bien establecidos para determinar sus concentraciones en los fluidos y tejidos biológicos. Aquí se presenta un protocolo para el método de quimioluminiscencia (CL), basado en la detección espectrofotométrico de NO después de nitrito o nitrato de reducción por (III) soluciones de cloruro de tri-yoduro o vanadio, respectivamente. La sensibilidad para la detección de nitrito y nitrato está en la gama baja nanomolar, que establece CL como el método más sensible disponible actualmente para determinar los cambios en las rutas metabólicas NO. Explicamos en detalle cómo preparar muestras de fluidos y tejidos biológicos con el fin de preservar el valor de origen de nitritos y nitratos presentes en el momento de la recogida y la forma de determinar sus respectivas cantidades en las muestras. Las limitaciones de la técnica CL también son explained.
Introduction
Nitrito y nitrato a un menos extender, los niveles en la sangre refleja el estado general del cuerpo NO metabolismo. las concentraciones de nitrito en la sangre y la mayoría de los órganos y tejidos son sólo en alta nanomolar o rango micromolar bajo, el nitrato es por lo general presentes en cantidades mucho más elevadas – en el rango micromolar. Los cambios en los niveles de nitritos debido a la progresión de la enfermedad o los cambios en los hábitos alimenticios son bastante pequeñas y sólo pueden ser medidos usando un método muy sensible. Debido a sus muy diferentes niveles y diferentes procesos metabólicos, determinación separada de los niveles de nitrito y nitrato es esencial. El llamado "NO determinación x", donde nitritos y nitratos se mide en conjunto tiene muy poco valor.
Se han desarrollado varios métodos para la cuantificación de nitrito en diversas muestras biológicas – siendo el más común el más antiguo, en base a la reacción de Griess que había sido descrito originalmente en 1879. Incluso con modificatio modernons, el límite de sensibilidad para el nitrito alcanzable por el método de Griess 'está en el rango bajo micromolar. Quimioluminiscencia (CL), combinado con tri-yoduro de solución reductora, se considera actualmente el método más sensible, lo que permite la cuantificación en el intervalo nanomolar bajo de concentraciones de nitrito 1-8,10,11. El mismo método CL, en combinación con vanadio (III) cloruro solución reductora, se puede utilizar para mediciones sensibles de nitrato, con precisión en el rango nanomolar 9.
CL detecta gas libre NO. Por lo tanto, nitrito, nitrato, R-nitrosotioles (R-SNO), R-nitrosaminas (R-NNO), o compuestos de metal-NO (más adelante en el manuscrito que se refiere como "R- (X) -NO"), deben ser convertidos en liberar el gas NO con el fin de cuantificar su valor de origen a través de CL. La conversión a NO se consigue utilizando varias soluciones de reducción diferentes, dependiendo de la naturaleza de la NO metabolito. Después de la conversión, libre de gas NO se purga del recipiente de reacción por un gas portador (He, N2 o Ar) en la cámara de reacción del analizador CL donde el ozono (O 3) se combina con el NO para formar dióxido de nitrógeno (NO 2) en su estado activado. Con el retorno al estado fundamental, NO2 * emite en la región del infrarrojo y fotón emitido es detectado por fotomultiplicador (PMT) del instrumento CL. La intensidad de la luz emitida es directamente proporcional a la concentración de NO en la cámara de reacción, que permite el cálculo de la concentración de la especie original utilizando curvas de calibración adecuados.
En nuestro protocolo, que la determinación basada en CL primer regalo de nitrito y nitrato en los entornos clínicos más utilizados – en la sangre y el plasma, y luego se discute cómo determinar estos iones en muestras de tejido. También explicamos en detalle cómo conservar la concentración de nitrito fisiológico original en entornos de nitrito-reactivos, tales como la sangre y sus compartimentos, plasma y células rojas de la sangre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Las alícuotas de todas las soluciones (incluyendo el agua) que se usan para preparar, diluir o tratar de otro modo las muestras originales tienen que ser guardados y revisados para su posible nitrito o (más a menudo) la contaminación por nitratos. Encontramos que la mayoría contaminación proviene del agua y muchos productos químicos utiliza para tratar la muestra (ferricianuro en particular) también contiene cantidad significativa de contami…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren reconocer las contribuciones importantes de Dr. A. Dejam y MM Pelletier en el desarrollo del uso de la solución de nitrito de preservar para las mediciones de nitritos en la sangre.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
Referências
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