Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
Die Entwicklung von Patienten stamm Tumorxenografte (PDXs), wobei operativ reseziert Tumorproben direkt transplantiert werden in immungeschwächten Mäusen, bietet mehrere Vorteile gegenüber Standard – Zell-Linie Xenotransplantatmodellen und stellt einen großen Fortschritt in der Krebsforschung 1,2. PDXs können durch aufeinanderfolgende Durchgänge mit minimalen Veränderung der genetischen und biologischen Eigenschaften des Tumors bei der ersten Passage gezüchtet gepflegt und erweitert werden; und genauer widerspiegeln Tumor Heterogenität als abgeleitet Xenotransplantate von menschlichen Krebszelllinien 3-8. Diese Modelle werden nun in großem Umfang als Plattform genutzt zur Personalisierung von Krebstherapeutika 9,10, als präklinische Plattform in der Medikamentenentwicklung 6,11 und als experimentelles Werkzeug für das Studium der Krebsbiologie 4,12.
Die meisten PDXs implantiert werden und subkutan propagiert, die feasibly Messung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit ermöglicht Sätteln mit. abermetastatische Erkrankung hat, war schwieriger zu modellieren PDXs verwenden. Speziell für Brustkrebs – Xenotransplantaten mit metastatischen Kapazität verschiedenen Organen haben 3,5,13 beschrieben worden ist , aber die Frequenz der spontanen Verbreitung an metastatischen Stellen ist extrem niedrig. Wo berichtet, stützt sich die Identifizierung und Quantifizierung von metastasierendem Belastung in mühsamer histologische Untersuchung von Zielorganen post-mortem. Krebs-Zelllinien Biolumineszenz (Luciferase, Luc) exprimieren, oder fluoreszierend (Green Fluorescent Protein, GFP) Gen-Reporter werden in experimentellen Modellen von Brustkrebs Metastasen in Gehirn, Lunge, Knochen und Leber nach intrakardial, Schwanz-Vene, intrafemoral und splenic Injektion häufig verwendete 14-16. Während diese Modelle Verbreitung von den primären Tumoren umgehen, sie sind wertvoll, die Mechanismen der Organtropismus und metastatischen Kolonisation zu studieren. Doch von primären Patiententumoren und PDXs abgeleiteten Zellen können niedrige Transfektion oder Transduktionsraten haben using Standardverfahren. Eine Alternative ist PDX-abgeleiteten Zelllinien in vitro zu etablieren 17, die als herkömmliche Gewebekulturprotokollen markiert werden können. Dieser Ansatz ist jedoch nicht geeignet für die meisten PDXs Kennzeichnung, für die Zell-Linie Ableitung schwierig und kann den Phänotyp der Zellen verändern. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Weiterleitung von PDX-distanzierte Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren , die sich für die de – vivo – Bildgebung. Darüber hinaus beschreiben wir experimentelle Metastasierung mit Intrakardial dissoziierter luc-GFP-markierten PDX-Zellen bei immunsupprimierten Mäusen.
Ein Basisprotokoll für die Transduktion von PDX-distanzierte Organoide mit Gen-Reporter exprimieren Lentiviren zuvor 18 beschrieben. In der aktuellen Protokoll beschreiben wir zusätzliche Methoden für das menschliche Tumorzellen zu bereichern und in der Nähe von 100% Transduktionseffizienz, sowie die Verwendung von markierten PDXs zum Nachweis von experimentellen Brustkrebs erhaltenMetastasen. Dieses Protokoll kann für die Markierung von mehreren Krebsarten PDXs mit verschiedenen Leucht und Fluoreszenzmarker sowie Modulation der Genexpression (dh shRNA Knockdown von Genen von Interesse) angepasst werden.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls:
Die Verwendung hoch Titer Lentivirale Partikel (> 10 8 TU / ml) ist ein entscheidender Schritt in den Erfolg dieses Protokolls, die sorgfältige Kontrolle der während der in vitro Transduktion Medienzusammensetzung ermöglicht. Während mehrere Methoden für die Herstellung von High-Titer viralen Partikel wurden gut 18,19 beschrieben; Dieses Protokoll verwendet lentivirale Partikel , wie im Detai…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Dr. Darrel Kotton an der Boston University für die Bereitstellung der Phage-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W-Vektor und Protokolle für hohe Titer lentiviralen Produktion in diesen Studien verwendet. Diese Arbeit wurde von DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) und R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Zentrum Zuschuss unterstützt de – vivo – Bildgebung gefördert und Gewebekultur-Kerne an der University of Colorado AMC.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |