We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
De ontwikkeling van de patiënt afgeleide tumor xenotransplantaten (PDXs), waarbij chirurgisch weggesneden tumor samples direct in immuun-gecompromitteerde muizen worden geënt, biedt een aantal voordelen ten opzichte van standaard cellijn xenograft modellen en vormt een belangrijke stap vooruit in het onderzoek naar kanker 1,2. PDXs kunnen worden gehandhaafd en uitgebreid door opeenvolgende doorgangen met een minimale verandering van de genetische en biologische eigenschappen van de tumor gegroeid bij de eerste doorgang; en een betere weerspiegeling van de tumor heterogeniteit dan xenotransplantaten afgeleid van kanker bij de mens cellijnen 3-8. Deze modellen worden nu op grote schaal gebruikt als platform voor het personaliseren van kanker geneeswijze 9,10, als een preklinische platform in de ontwikkeling van geneesmiddelen 6,11 en als een experimenteel instrument voor de studie van de biologie van kanker 4,12.
De meeste PDXs worden geïmplanteerd en subcutaan gepropageerd, die haalbaar maakt meting van de groei van de tumor in de tijd met behulp van remklauwen. Echter, Metastatische ziekte is moeilijker geweest om te modelleren met behulp van PDXs. Specifiek voor borstkanker xenotransplantaten met metastatische vermogen uiteenlopende organen beschreven 3,5,13, maar de frequentie van spontane verspreiding metastasen is extreem laag. Wanneer gemeld, de identificatie en kwantificatie van metastatische last beroept zich moeizaam histologisch onderzoek van doelorganen post-mortem. cel kanker lijnen tot expressie bioluminescent (luciferase, Luc) of fluorescentie (Green Fluorescent Protein, GFP) gen reporters worden vaak gebruikt in experimentele modellen van borstkanker uitzaaiingen hersenen, longen, bot en lever na intracardiale, staart-ader, intrafemoral en milt injectie 14-16. Hoewel deze modellen omzeilen verspreiding van de primaire tumoren, zijn ze waardevol voor de mechanismen van orgaan tropisme en metastatische kolonisatie bestuderen. Echter, cellen afkomstig van primaire tumoren en patiënt PDXs kunnen lage transfectie of transductie tarieven usin hebbeng-standaard procedures. Een alternatief is PDX-afgeleide cellijnen in vitro vastgesteld 17, die vervolgens kan worden gelabeld met conventionele weefselkweek protocollen. Deze aanpak is echter niet geschikt voor het labelen meeste PDXs waarvoor cellijn afleiding moeilijk en kan het fenotype van de cellen te veranderen. Hier presenteren we een protocol voor transductie van PDX-gedissocieerde tumorcellen met lentivirale vectoren die geschikt zijn voor in vivo beeldvorming. Daarnaast beschrijven we experimenteel métastase via intracardiale injectie van gedissocieerde luc-GFP gemerkte cellen PDX in immuungecompromitteerde muizen.
Een basis protocol voor transductie van PDX-gedissocieerd organoids met gen-reporter tot expressie lentivirus is eerder beschreven 18. In het huidige protocol andere methoden beschrijven we te verrijken voor humane tumorcellen en het verkrijgen van bijna 100% transductie efficiëntie en het gebruik van gelabelde PDXs voor het detecteren experimentele borstkankermetastasen. Dit protocol kan worden aangepast voor het labelen van verschillende kankersoorten PDXs met verschillende luminescerende en fluorescerende merkers en modulatie van genexpressie (dat wil zeggen, shRNA knockdown van genen van belang).
Kritische stappen in het protocol:
Het gebruik van hoge titer lentivirale deeltjes (> 10 8 TU / ml) is een kritische stap in het succes van dit protocol, zoals laat zorgvuldige controle van de mediumsamenstelling tijdens in vitro transductie. Hoewel verschillende werkwijzen voor de productie van hoge titer virale deeltjes zijn goed beschreven 18,19; Dit protocol gebruikt lentivirale deeltjes zoals uitgebreid beschreven in <a href="http://www…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken dr Darrel Kotton aan de Boston University voor het verstrekken van de faag-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vector en protocollen voor hoge titer lentivirale productie gebruikt in deze studies. Dit werk werd gefinancierd door DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) en R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Center subsidie ondersteund in vivo imaging en weefselkweek kernen aan de Universiteit van Colorado AMC.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |