Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios
Summary
Se describe un método para el marcaje estable de xenoinjertos derivados del paciente (PDXs) con partículas lentivirales que expresan la proteína y luciferasa indicadores verdes fluorescentes. Este método permite el seguimiento del crecimiento de PDXs en el sitio principal, así como la detección de metástasis espontáneas y experimentales utilizando pt sistemas de imágenes in vivo.
Abstract
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
Introduction
El desarrollo de xenoinjertos derivados de pacientes tumorales (PDXs), donde las muestras de tumor resecado quirúrgicamente injertados directamente en ratones inmunocomprometidos, ofrece varias ventajas sobre los modelos estándar de xenoinjertos de la línea celular y representa un avance importante en la investigación del cáncer 1,2. PDXs pueden ser mantenidos y expandido en pasajes sucesivos con una mínima alteración de las características genéticas y biológicas del tumor crecido en el primer paso; y reflejar con mayor precisión la heterogeneidad del tumor de xenoinjertos derivados de las líneas celulares de cáncer humano 3-8. Estos modelos se utilizan ahora ampliamente como una plataforma para la personalización de la terapéutica del cáncer 9,10, como una plataforma preclínica en el desarrollo de fármacos y 6,11 como una herramienta experimental para el estudio de la biología del cáncer 4,12.
La mayoría de PDXs se implantan y se propagan por vía subcutánea, que permite que sea viable la medición del crecimiento del tumor con el tiempo usando calibradores. sin embargo, La enfermedad metastásica ha sido más difícil de modelar utilizando PDXs. Específicamente para el cáncer de mama, xenoinjertos con capacidad metastásica a los diferentes órganos se han descrito 3,5,13, pero la frecuencia de difusión espontánea a los sitios de metástasis es extremadamente baja. Cuando se informó, la identificación y cuantificación de la carga metastásico se basa en el examen histológico de los órganos diana laboriosa post-mortem. líneas celulares de cáncer que expresan bioluminiscente (luciferasa, Luc) o fluorescente (proteína verde fluorescente, GFP) reporteros de genes se utilizan comúnmente en modelos experimentales de metástasis de cáncer de mama a cerebro, pulmón, hueso e hígado después de intracardíaca, cola-vena, intrafemoral y la inyección esplénica 14-16. Aunque estos modelos evitan la difusión de los tumores primarios, que son valiosos para estudiar los mecanismos de tropismo de órganos y la colonización metastásica. Sin embargo, las células derivadas de tumores de pacientes primarios y PDXs pueden tener baja las tasas de transfección o transducción using procedimientos estándar. Una alternativa es establecer líneas celulares derivadas de PDX in vitro 17, que puede ser etiquetado a continuación, utilizando protocolos de cultivo de tejidos convencionales. Esta estrategia, sin embargo, no es adecuado para la mayoría de etiquetado PDXs, para lo cual la línea de células derivación es difícil y puede cambiar el fenotipo de las células. Aquí se presenta un protocolo para la transducción de las células tumorales disociadas-PDX con lentiviral vectores adecuados para la formación de imágenes in vivo. Además, se describe la metástasis experimental usando inyección intracardíaca de células PDX luc-GFP etiquetados disociadas en ratones inmunocomprometidos.
Un protocolo básico para la transducción de organoides disociadas-PDX con el gen reportero que expresa lentivirus se ha descrito previamente 18. En el protocolo actual se describen métodos adicionales para enriquecer en células tumorales humanas y obtener cerca de la eficiencia de transducción de 100%, así como el uso de PDXs marcados para la detección de cáncer de mama experimentalmetástasis. Este protocolo se puede adaptar para el etiquetado de múltiples tipos de cáncer de PDXs con diversos marcadores luminiscentes y fluorescentes, así como la modulación de la expresión génica (es decir, desmontables shRNA de genes de interés).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo:
El uso de partículas de lentivirus de título alto (> 10 8 TU / ml) es un paso crítico en el éxito de este protocolo, ya que permite un control cuidadoso de la composición de los medios de comunicación durante la transducción in vitro. Si bien varios métodos para la producción de partículas virales de alto título han sido bien descritos 18,19; Este protocolo utiliza partículas lentivirales prod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Darrel Kotton la Universidad de Boston para proporcionar el fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W de vectores y protocolos para la producción de lentivirus de alto título usado en estos estudios. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), el NCI K22CA181250 (DMC) y R01 CA140985 (CAS) subvención .NCI P30CA046934 Centro apoyado pt imágenes in vivo y el cultivo de tejidos núcleos a Universidad de Colorado AMC.
Materials
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70um filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
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