Nous décrivons une méthode pour l'étiquetage stable de xénogreffes dérivées de patients (PDXs) avec des particules lentiviraux exprimant la protéine et la luciférase reporters vert fluorescent. Cette méthode permet de suivre la croissance de PDXs au niveau du site primaire, ainsi que la détection des métastases spontanées et expérimentales en utilisant des systèmes d'imagerie in vivo.
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
Le développement de xénogreffes dérivées de patients tumorales (PDXs), où des échantillons de tumeurs réséquées chirurgicalement sont greffées directement dans des souris immunodéprimées, offre plusieurs avantages par rapport aux modèles standards de xénogreffes de lignées cellulaires et représente une avancée majeure dans la recherche sur le cancer 1,2. PDXs peuvent être maintenues et développées par des passages successifs avec un minimum de modifications des caractéristiques génétiques et biologiques de la tumeur développée au premier passage; et refléter plus précisément l' hétérogénéité tumorale de xénogreffes dérivées de lignées de cellules cancéreuses humaines 3-8. Ces modèles sont maintenant largement utilisés comme une plate – forme pour la personnalisation thérapeutique du cancer 9,10, comme une plate – forme préclinique dans le développement de médicaments 6,11 et comme un outil expérimental pour l' étude de la biologie du cancer 4,12.
La plupart PDXs sont implantés et propagées par voie sous- cutanée, ce qui permet en pratique en mesure de la croissance de la tumeur au fil du temps en utilisant des compas. toutefois, La maladie métastatique a été plus difficile à modéliser en utilisant PDXs. En particulier pour le cancer du sein, des xénogreffes avec une capacité métastatique aux différents organes ont été décrits 3,5,13, mais la fréquence de la dissémination spontanée de sites métastatiques est extrêmement faible. Où signalé, l'identification et la quantification de la charge métastatique repose sur l'examen histologique laborieux des organes cibles post-mortem. des lignées de cellules cancéreuses exprimant bioluminescente (luciférase, de Luc) ou de fluorescence (protéine fluorescente verte, GFP) reporters de gènes sont couramment utilisés dans des modèles expérimentaux de métastases du cancer du sein au cerveau, les poumons, les os et le foie après intracardiaque, la queue veine intrafemoral et l'injection splénique 14-16. Bien que ces modèles contournent la diffusion des tumeurs primaires, ils sont précieux pour étudier les mécanismes de tropisme d'organe et de la colonisation métastatique. Cependant, les cellules dérivées de tumeurs et PDXs patients primaires peuvent avoir une faible transfection ou les taux de transduction using procédures standard. Une alternative consiste à établir des lignées cellulaires dérivées PDX-17 in vitro, qui peut être ensuite marqué en utilisant des protocoles de culture de tissus classiques. Cependant, cette approche ne convient pas à l'étiquetage la plupart des PDXs, pour lequel la lignée cellulaire dérivée est difficile et peut changer le phénotype des cellules. Ici , nous présentons un protocole pour la transduction de cellules tumorales dissociées PDX avec des vecteurs lentiviraux appropriés pour l' imagerie in vivo. En outre, nous décrivons des métastases expérimentales par injection intracardiaque de cellules PDX-luc GFP marquées dissociées dans des souris immunodéprimées.
Un protocole de base pour la transduction des organites PDX-dissociées avec lentivirus gène rapporteur exprimant a déjà été décrit 18. Dans le protocole en vigueur, nous décrivons des procédés supplémentaires pour enrichir les cellules tumorales humaines et d'obtenir près de 100% d'efficacité de transduction, ainsi que l'utilisation de PDXs marquées pour détecter le cancer du sein expérimentalmétastases. Ce protocole peut être adapté pour le marquage de plusieurs types de cancer de PDXs avec différents marqueurs luminescents et fluorescents, ainsi que la modulation de l' expression génique ( par exemple, shRNA knock – down de gènes d'intérêt).
Les étapes critiques au sein du protocole:
L'utilisation de particules lentiviraux à titre élevé (> 10 8 TU / ml) est une étape critique dans le succès de ce protocole, que permet un contrôle minutieux de la composition des médias pendant la transduction in vitro. Bien que plusieurs méthodes pour la production de particules virales à titre élevé ont été bien décrits 18,19; ce protocole utilise des particul…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le Dr Darrel Kotton à l'Université de Boston pour fournir le-EF1aL-DsRed-UBC-GFP-W vecteur de phage et des protocoles pour la production de lentiviral à titre élevé utilisés dans ces études. Ce travail a été financé par le DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) et R01 CA140985 (CAS) .NCI P30CA046934 Centre subvention prise pt charge dans l' imagerie in vivo et la culture de tissus noyaux à l'Université du Colorado AMC.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |