Xenopus oocytter: Optimeret Metoder til mikroinjektion, Fjernelse af Follikulære cellelag og hurtig løsning Ændringer i Elektrofysiologiske Eksperimenter
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
Xenopus oocyt som et heterologt ekspressionssystem for proteiner, blev først beskrevet af Gurdon et al. 1 og har været almindeligt anvendt siden dens opdagelse (Referencer 2 – 3, og referencer deri). En egenskab, der gør ægget attraktivt for udenlandske kanal udtryk er den dårlige overflod af endogene ionkanaler 4. Dette ekspressionssystem har vist sig nyttig til karakterisering af mange proteiner, blandt dem ligandstyrede ionkanaler.
Ekspressionen af GABAA-receptorer i Xenopus oocyter og deres funktionelle karakterisering er beskrevet her, herunder isolering af oocytter, mikroinjektioner med cRNA, fjernelse af follikulære cellelag, og hurtig løsning ændringer i elektrofysiologiske forsøg. Procedurerne blev optimeret i dette laboratorium 5,6 og afvige fra dem rutinemæssigt anvendes 7-9. Traditionelt er blotlagte oocytter fremstillesmed en forlænget collagenase behandling af ovarie lapper ved stuetemperatur, og disse blotlagte oocytter mikroinjiceres med mRNA. Under anvendelse af de optimerede metoder, har forskellige membranproteiner blevet udtrykt og studeret med dette system, såsom rekombinante GABAA-receptorer 10-12, humane rekombinante chloridkanaler 13, trypanosominfektion kaliumkanaler 14 og en myo-inositol transportør 15, 16.
De beskrevne metoder her kan anvendes til ekspression af ethvert protein af valg i Xenopus oocytter, og den hurtige opløsning forandring kan anvendes til at studere andre ligand-gatede ionkanaler.
Introduction
Xenopus-oocytter er almindeligt anvendt som et ekspressionssystem (Referencer 2 – 3, og referencer deri). De er i stand til korrekt samle og optage funktionelt aktive multisubunit proteiner i deres plasmamembraner. Med dette system er det muligt at funktionelt undersøge membranproteiner alene eller i kombination med andre proteiner, med henblik på at studere egenskaberne af muterede, kimære eller sammenkædede proteiner og at screene potentielle lægemidler.
Fordele ved at anvende oocytter frem for andre heterologe ekspressionssystemer indbefatter den enkle håndtering af kæmpeceller, den høje andel af celler, der udtrykker fremmed genetisk information, den simple styring af miljøet af oocytten ved hjælp af bad perfusion, og kontrollen med membranpotentialet .
Ulempen ved dette udtryk system er den sæsonvariation observeret i mange laboratorier 17-20. Årsagen til denne variationer langt fra klart. Derudover er kvaliteten af oocytter ofte observeret at variere kraftigt. Traditionelle metoder 7-9 har omfattet isoleringen af ovarie lapper, eksponeringen af ovarieceller lapper til collagenase for nogle timer, udvælgelse af blotlagte oocytter, og oocytten mikroinjektion. Her rapporteres en række alternative, hurtige procedurer, der har givet os mulighed for at arbejde med dette udtryk for mere end 30 år uden sæsonvariation og lidt variation i oocyt kvalitet.
De modificerede og forbedrede fremgangsmåder beskrevet her til isoleringen af oocytter, mikroinjektion med cRNA, og fjernelse af follikulære cellelag kan anvendes til ekspression af ethvert protein af valg i Xenopus-oocyt. Den meget simpel metode til hurtig løsning ændringer af mediet omkring oocytten kan påføres på studiet af enhver ligand-gatede ionkanal og bærere.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrives i denne artikel metoder afviger fra dem, der anvendes traditionelt 7-9. Det er standard at blotlægge kamre af ovariet til en 1 til 2 h collagenasebehandling 8; isolere ubeskadigede, blotlagte oocytter; og injicere dem med mRNA under anvendelse af kommercielle injektionsindretninger. Denne klassiske fremgangsmåde har følgende ulemper: 1) sandsynligvis vil blive beskadiget af den lange eksponering for høje koncentrationer af collagenase oocytter. 2) De ustabile blotlagte oocytter ska…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
