Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Xenopus oocyt som et heterologt ekspressionssystem for proteiner, blev først beskrevet af Gurdon et al. 1 og har været almindeligt anvendt siden dens opdagelse (Referencer 2 – 3, og referencer deri). En egenskab, der gør ægget attraktivt for udenlandske kanal udtryk er den dårlige overflod af endogene ionkanaler 4. Dette ekspressionssystem har vist sig nyttig til karakterisering af mange proteiner, blandt dem ligandstyrede ionkanaler.
Ekspressionen af GABAA-receptorer i Xenopus oocyter og deres funktionelle karakterisering er beskrevet her, herunder isolering af oocytter, mikroinjektioner med cRNA, fjernelse af follikulære cellelag, og hurtig løsning ændringer i elektrofysiologiske forsøg. Procedurerne blev optimeret i dette laboratorium 5,6 og afvige fra dem rutinemæssigt anvendes 7-9. Traditionelt er blotlagte oocytter fremstillesmed en forlænget collagenase behandling af ovarie lapper ved stuetemperatur, og disse blotlagte oocytter mikroinjiceres med mRNA. Under anvendelse af de optimerede metoder, har forskellige membranproteiner blevet udtrykt og studeret med dette system, såsom rekombinante GABAA-receptorer 10-12, humane rekombinante chloridkanaler 13, trypanosominfektion kaliumkanaler 14 og en myo-inositol transportør 15, 16.
De beskrevne metoder her kan anvendes til ekspression af ethvert protein af valg i Xenopus oocytter, og den hurtige opløsning forandring kan anvendes til at studere andre ligand-gatede ionkanaler.
Xenopus-oocytter er almindeligt anvendt som et ekspressionssystem (Referencer 2 – 3, og referencer deri). De er i stand til korrekt samle og optage funktionelt aktive multisubunit proteiner i deres plasmamembraner. Med dette system er det muligt at funktionelt undersøge membranproteiner alene eller i kombination med andre proteiner, med henblik på at studere egenskaberne af muterede, kimære eller sammenkædede proteiner og at screene potentielle lægemidler.
Fordele ved at anvende oocytter frem for andre heterologe ekspressionssystemer indbefatter den enkle håndtering af kæmpeceller, den høje andel af celler, der udtrykker fremmed genetisk information, den simple styring af miljøet af oocytten ved hjælp af bad perfusion, og kontrollen med membranpotentialet .
Ulempen ved dette udtryk system er den sæsonvariation observeret i mange laboratorier 17-20. Årsagen til denne variationer langt fra klart. Derudover er kvaliteten af oocytter ofte observeret at variere kraftigt. Traditionelle metoder 7-9 har omfattet isoleringen af ovarie lapper, eksponeringen af ovarieceller lapper til collagenase for nogle timer, udvælgelse af blotlagte oocytter, og oocytten mikroinjektion. Her rapporteres en række alternative, hurtige procedurer, der har givet os mulighed for at arbejde med dette udtryk for mere end 30 år uden sæsonvariation og lidt variation i oocyt kvalitet.
De modificerede og forbedrede fremgangsmåder beskrevet her til isoleringen af oocytter, mikroinjektion med cRNA, og fjernelse af follikulære cellelag kan anvendes til ekspression af ethvert protein af valg i Xenopus-oocyt. Den meget simpel metode til hurtig løsning ændringer af mediet omkring oocytten kan påføres på studiet af enhver ligand-gatede ionkanal og bærere.
De beskrives i denne artikel metoder afviger fra dem, der anvendes traditionelt 7-9. Det er standard at blotlægge kamre af ovariet til en 1 til 2 h collagenasebehandling 8; isolere ubeskadigede, blotlagte oocytter; og injicere dem med mRNA under anvendelse af kommercielle injektionsindretninger. Denne klassiske fremgangsmåde har følgende ulemper: 1) sandsynligvis vil blive beskadiget af den lange eksponering for høje koncentrationer af collagenase oocytter. 2) De ustabile blotlagte oocytter ska…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
NaCl | Sigma | 71380 | |
KCl | Sigma | P-9541 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
CaCl2 | Sigma | 223560 | |
Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
Platinum wire loop | home-made | ||
Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
EGTA | Sigma | E3389 | |
Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |