Xenopus의 난 모세포 : 미세 주입을위한 최적화 방법, 여포 세포 레이어의 제거 및 전기 생리 실험에서 빠른 해결 방법 변경
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
단백질 이종 발현 시스템으로 제노 푸스 난 모세포는 제 Gurdon 동부 등에 의해 설명되었다. 1 널리 발견부터 사용되었다 (참고 문헌 2-3 및 참조 내부). 외국 채널 식의 난자가 매력적인 만드는 특징은 내생 이온 채널 4의 가난한 풍부하다. 이 발현 시스템은 리간드 게이트 이온 채널 그들 가운데 많은 단백질의 특성에 유용 입증되었습니다.
GABA의 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포 수용체와 기능적 특성의 발현은 난자, cRNA를, 여포 세포 층의 제거 및 전기 생리학 실험에서 빠른 솔루션 변경 microinjections의 분리를 포함하여, 여기에 설명되어 있습니다. 절차는이 실험 5,6에 최적화되어 있으며 정기적으로 7-9을 사용하는 것 이탈했다. 전통적으로, 무 결함 난자 제조RT에서 난소 로브의 연장 콜라게나 제 처리, 이러한 무 결함 난자와의 mRNA와 미세 주입된다. 최적화 된 방법을 사용하여 다양한 막 단백질은 발현되고 그러한 재조합 GABA A는 수용체 10-12 인간 재조합 클로라이드 채널 (13), 트리파노소마 칼륨 채널 (14), 및 미오의 -inositol 전달체 (15, 16),이 시스템을 연구 하였다.
여기에 설명 된 방법은 한 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 선택 중의 단백질의 발현에인가 될 수 있고, 신속한 용액 변경은 다른 리간드 관문 이온 채널을 연구하는데 사용될 수있다.
Introduction
제노 푸스 난 모세포 널리 (- 3, 참조 내부 참조 2) 발현 시스템으로서 사용된다. 이들은 적절히 조합 및 세포막에 기능적 활성 multisubunit 단백질을 포함 할 수있다. 이 시스템을 사용하면, 기능적으로, 단독으로 또는 다른 단백질과 결합 막 단백질을 조사 돌연변이 키메라 또는 연접 단백질의 성질을 연구하기 위해, 잠재적 약물을 스크리닝 할 수있다.
다른 이종 발현 시스템을 통해 난자를 사용 이점은 거대 세포의 간단한 처리 외국 유전 정보, 목욕 관류에 의해 난자의 환경의 간단한 제어를 발현하는 세포의 비율이 높은, 상기 막 전위의 제어를 포함 .
이러한 발현 시스템의 단점은 많은 실험실 17-20에서 관찰 계절 변동이다. 이러한 변화의 원인분명 거리가 멀다. 또한 난자의 품질이 종종 크게 변화하는 것으로 관찰된다. 전통적인 방법 7-9 난소 로브의 분리, 몇 시간 동안 콜라게나 제에 난소 로브의 노출, 무 결함 난자의 선택, 그리고 난자의 미세 주입을 포함했다. 여기서, 대안, 빠른 절차의 수는 우리가 난자의 질에 어떤 계절의 변화와 약간의 변화와 함께 30 년 이상이 발현 시스템에서 작동하도록 허용 한 것을보고됩니다.
난 모세포의 분리, cRNA를 미세 주사로하고, 모낭 세포 층의 제거를 위해 여기에 설명 된 수정 및 개선 방법은 제노 푸스 난 모세포에서 선택한 임의의 단백질의 발현을 위해 사용될 수있다. 난자 주위 매질의 빠른 변화 용액의 아주 간단한 방법은 리간드 개폐 통로와 캐리어들의 연구에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 설명하는 방법은 전통적으로 7-9 사용되는 일탈. 1 내지 2 시간 콜라게나 제 처리 8 난소 로브를 노출하는 표준이다; 손상되지 않은, 무 결함 난 모세포를 분리; mRNA를 상업적 분사 장치를 사용하여 그것들을 주입. 난자게나 고농도로 긴 노출에 의해 손상 될 가능성이있다 1)이 고전 절차는 다음과 같은 단점을 갖는다. 2) 불안정 무 결함 난자가 실험까지 저장해야합니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
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