Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
단백질 이종 발현 시스템으로 제노 푸스 난 모세포는 제 Gurdon 동부 등에 의해 설명되었다. 1 널리 발견부터 사용되었다 (참고 문헌 2-3 및 참조 내부). 외국 채널 식의 난자가 매력적인 만드는 특징은 내생 이온 채널 4의 가난한 풍부하다. 이 발현 시스템은 리간드 게이트 이온 채널 그들 가운데 많은 단백질의 특성에 유용 입증되었습니다.
GABA의 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포 수용체와 기능적 특성의 발현은 난자, cRNA를, 여포 세포 층의 제거 및 전기 생리학 실험에서 빠른 솔루션 변경 microinjections의 분리를 포함하여, 여기에 설명되어 있습니다. 절차는이 실험 5,6에 최적화되어 있으며 정기적으로 7-9을 사용하는 것 이탈했다. 전통적으로, 무 결함 난자 제조RT에서 난소 로브의 연장 콜라게나 제 처리, 이러한 무 결함 난자와의 mRNA와 미세 주입된다. 최적화 된 방법을 사용하여 다양한 막 단백질은 발현되고 그러한 재조합 GABA A는 수용체 10-12 인간 재조합 클로라이드 채널 (13), 트리파노소마 칼륨 채널 (14), 및 미오의 -inositol 전달체 (15, 16),이 시스템을 연구 하였다.
여기에 설명 된 방법은 한 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포의 선택 중의 단백질의 발현에인가 될 수 있고, 신속한 용액 변경은 다른 리간드 관문 이온 채널을 연구하는데 사용될 수있다.
제노 푸스 난 모세포 널리 (- 3, 참조 내부 참조 2) 발현 시스템으로서 사용된다. 이들은 적절히 조합 및 세포막에 기능적 활성 multisubunit 단백질을 포함 할 수있다. 이 시스템을 사용하면, 기능적으로, 단독으로 또는 다른 단백질과 결합 막 단백질을 조사 돌연변이 키메라 또는 연접 단백질의 성질을 연구하기 위해, 잠재적 약물을 스크리닝 할 수있다.
다른 이종 발현 시스템을 통해 난자를 사용 이점은 거대 세포의 간단한 처리 외국 유전 정보, 목욕 관류에 의해 난자의 환경의 간단한 제어를 발현하는 세포의 비율이 높은, 상기 막 전위의 제어를 포함 .
이러한 발현 시스템의 단점은 많은 실험실 17-20에서 관찰 계절 변동이다. 이러한 변화의 원인분명 거리가 멀다. 또한 난자의 품질이 종종 크게 변화하는 것으로 관찰된다. 전통적인 방법 7-9 난소 로브의 분리, 몇 시간 동안 콜라게나 제에 난소 로브의 노출, 무 결함 난자의 선택, 그리고 난자의 미세 주입을 포함했다. 여기서, 대안, 빠른 절차의 수는 우리가 난자의 질에 어떤 계절의 변화와 약간의 변화와 함께 30 년 이상이 발현 시스템에서 작동하도록 허용 한 것을보고됩니다.
난 모세포의 분리, cRNA를 미세 주사로하고, 모낭 세포 층의 제거를 위해 여기에 설명 된 수정 및 개선 방법은 제노 푸스 난 모세포에서 선택한 임의의 단백질의 발현을 위해 사용될 수있다. 난자 주위 매질의 빠른 변화 용액의 아주 간단한 방법은 리간드 개폐 통로와 캐리어들의 연구에 적용될 수있다.
이 문서에서 설명하는 방법은 전통적으로 7-9 사용되는 일탈. 1 내지 2 시간 콜라게나 제 처리 8 난소 로브를 노출하는 표준이다; 손상되지 않은, 무 결함 난 모세포를 분리; mRNA를 상업적 분사 장치를 사용하여 그것들을 주입. 난자게나 고농도로 긴 노출에 의해 손상 될 가능성이있다 1)이 고전 절차는 다음과 같은 단점을 갖는다. 2) 불안정 무 결함 난자가 실험까지 저장해야합니다. …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
NaCl | Sigma | 71380 | |
KCl | Sigma | P-9541 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
CaCl2 | Sigma | 223560 | |
Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
Platinum wire loop | home-made | ||
Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
EGTA | Sigma | E3389 | |
Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |