Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
L'ovocyte de Xenopus comme un système d'expression hétérologue des protéines, a été décrite par Gurdon et al. 1 et a été largement utilisé depuis sa découverte (Références 2 – 3, et les références qui y sont). Une caractéristique qui rend l'ovocyte attrayant pour l' expression de chaîne étrangère est la faible abondance de canaux ioniques endogènes 4. Ce système d'expression se sont révélées utiles pour la caractérisation de nombreuses protéines, parmi lesquelles des canaux ioniques ligand-dépendants.
L'expression des récepteurs GABA A dans les ovocytes de Xenopus et de leur caractérisation fonctionnelle est décrite ici, y compris l'isolement d'ovocytes, des microinjections de l' ARNc, l'enlèvement des couches de cellules folliculaires, et les changements rapides de solutions dans des expériences électrophysiologiques. Les procédures ont été optimisés dans ce laboratoire 5,6 et dévient de ceux couramment utilisés 7-9. Traditionnellement, les ovocytes dénudés sont préparésavec un traitement prolongé de la collagénase des lobes d'ovaire à la température ambiante, et ces ovocytes dénudés sont microinjecté avec l'ARNm. En utilisant les procédés optimisés, des protéines membranaires diverses ont été exprimées et étudié avec ce système, tels que les récepteurs recombinants GABA A 10-12, les canaux chlorure humains recombinants 13, trypanosomes canaux de potassium 14 et un transporteur de myo – inositol 15, 16.
Les méthodes décrites ici peuvent être appliquées à l'expression d'une protéine de choix dans les ovocytes de Xenopus, et le changement rapide de la solution peut être utilisée pour étudier d' autres canaux ioniques ligand-dépendants.
Introduction
Des ovocytes de Xenopus sont largement utilisés en tant que système d'expression (références 2 – 3, et les références qui s'y trouvent ). Ils sont capables d'assembler et d'intégrer des protéines fonctionnellement actives dans unités multiples leurs membranes plasmiques correctement. En utilisant ce système, il est possible d'étudier les protéines de membrane fonctionnelle seules ou en combinaison avec d'autres protéines, en vue d'étudier les propriétés de la ou des protéines chimères, des mutants concaténés, et pour cribler des médicaments potentiels.
Avantages de l'utilisation d'ovocytes sur les autres systèmes d'expression hétérologues comprennent la manipulation simple des cellules géantes, la forte proportion de cellules exprimant l'information génétique étrangère, le simple contrôle de l'environnement de l'ovocyte au moyen d'un bain de perfusion, et le contrôle du potentiel de membrane .
L'inconvénient de ce système d'expression est la variation saisonnière observée dans de nombreux laboratoires 17-20. La raison de cette variationest loin d'être clair. En outre, la qualité des ovocytes est souvent observée pour faire varier fortement. Les méthodes traditionnelles 7-9 ont inclus l'isolement des lobes de l' ovaire, l'exposition des lobes de l' ovaire à la collagénase pendant un certain h, la sélection des ovocytes dénudés, et la microinjection ovocytaire. Ici, un certain nombre de procédures, rapides alternatives sont rapportées qui nous ont permis de travailler avec ce système d'expression depuis plus de 30 ans, sans variation saisonnière et peu de variation dans la qualité de l'ovocyte.
Les procédés modifiés et améliorés décrits ici pour l'isolement d'ovocytes, la micro – injection de l' ARNc et l' enlèvement des couches de cellules folliculaires peuvent être utilisés pour l'expression d'une protéine de choix dans l'ovocyte de Xenopus. La méthode très simple pour les changements de solution rapide du milieu autour de l'ovocyte peut être appliqué à l'étude d'un canal ionique ligand-dépendant et des supports.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites dans cet article diffèrent de celles utilisées traditionnellement 7-9. Il est classique d'exposer les lobes de l'ovaire a 1 à 2 heures de traitement par la collagénase 8; isoler en bon état, ovocytes dénudés; et les injecter avec de l'ARNm en utilisant des dispositifs d'injection commerciaux. Cette procédure classique présente les inconvénients suivants: 1) Les ovocytes sont susceptibles d'être endommagés par l'exposition prolongée à des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
