Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
De Xenopus oöcyt als een heteroloog expressiesysteem voor eiwitten, werd eerst beschreven door Gurdon et al. 1 en is op grote schaal gebruikt sinds zijn ontdekking (referenties 2-3, en referenties daarin). Een kenmerk dat de eicel aantrekkelijk voor buitenlandse kanaal expressie maakt is de slechte overvloed van endogene ionkanalen 4. Het expressiesysteem is nuttig voor het karakteriseren van verschillende proteïnen, waaronder ligand-gated ionkanalen bewezen.
De expressie van GABAA-receptoren in Xenopus oocyten en hun functionele karakterisatie wordt beschreven, inclusief isolatie oöcyten, micro-injecties met cRNA, de verwijdering van folliculaire cellagen en snelle oplossing veranderingen in elektrofysiologische experimenten. De procedures werden geoptimaliseerd in dit laboratorium 5,6 en afwijken van die welke routinematig gebruikt 7-9. Traditioneel worden ontdaan oöcyten bereidmet een verlengde collagenase behandeling van ovarium lobben bij kamertemperatuur en deze blootgelegde oöcyten gemicroinjecteerd met mRNA. Met de geoptimaliseerde methoden hebben verschillende membraaneiwitten tot expressie gebracht en onderzocht met dit systeem, zoals recombinante GABA A-receptoren 10-12, menselijk recombinant chloride kanalen 13, Trypanosoom kaliumkanalen 14 en een myo-inositol transporter 15, 16.
De hier beschreven werkwijzen kunnen worden toegepast voor de expressie van een eiwit van keuze in Xenopus oöcyten, en de snelle verandering oplossing kan worden gebruikt om andere ligand-gated ionkanalen bestuderen.
Introduction
Xenopus oöcyten worden veel gebruikt als een expressiesysteem (referenties 2-3, en referenties daarin). Ze kunnen goed assembleren en op te nemen functioneel actief multisubunit eiwitten in de plasmamembranen. Met dit systeem is het mogelijk om functioneel onderzoek membraaneiwitten alleen of in combinatie met andere proteïnen, teneinde de eigenschappen van gemuteerde chimere of aaneengeschakelde proteïnen, en potentiële geneesmiddelen te screenen.
Voordelen van oöcyten opzichte van andere heterologe expressiesystemen omvatten de eenvoudige bediening van de reuscellen, het hoge aandeel van cellen die vreemde genetische informatie, de eenvoudige besturing van de van eicel middels bad perfusie en de controle van de membraanpotentiaal .
Het nadeel van dit expressiesysteem is de seizoensgebonden variatie waargenomen in veel laboratoria 17-20. De reden voor deze variatieis verre van duidelijk. Bovendien wordt de kwaliteit van de oöcyten waargenomen vaak sterk variëren. Traditionele methoden 7-9 hebben de isolatie van eierstok lobben, de blootstelling van eierstok kwabben om collagenase voor een aantal uur, de selectie van de blootgelegde eicellen en de eicel micro-injectie opgenomen. Hier wordt een aantal alternatieve, snelle procedures gerapporteerd die konden we met dit expressiesysteem meer dan 30 jaar zonder seizoensgebonden variatie en weinig variatie in kwaliteit van de oöcyten.
De gewijzigde en verbeterde werkwijzen beschreven voor het isoleren van oöcyten, micro-injectie met cRNA en verwijdering van folliculaire lagen kunnen worden gebruikt voor de expressie van een eiwit van keuze in het Xenopus oöcyt. De eenvoudige werkwijze voor snelle oplossing verandert van het medium rond de eicel kan worden toegepast op de studie van elke ligand-gated ionkanaal en dragers.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit artikel beschreven methoden afwijken van die van oudsher 7-9 gebruikt. Standaard worden de lobben van de eierstok blootstellen aan een 1-2 uur collagenase behandeling 8; isoleren onbeschadigd, ontdaan eicellen; en injecteren mRNA met gebruik van commerciële injecteerinrichtingen. Deze klassieke werkwijze heeft de volgende nadelen: 1) Eicellen waarschijnlijk beschadigd door langdurige blootstelling aan hoge concentraties collagenase. 2) De onstabiele blootgelegde oöcyten worden opgeslage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
- Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).
- Soreq, H. The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes. CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).
- Sigel, E. Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins. J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).
- Dascal, N. The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels. CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).
- Sigel, E. Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid. J Physiol. 386, 73-90 (1987).
- Sigel, E., Minier, F. The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins. Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).
- Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. Transcription and Translation’A Practical Approach. , 49-69 (1984).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Defolliculation of Xenopus oocytes. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).
- Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital. Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).
- Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity. Sci Rep. 6, 25943 (2016).
- Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).
- Burgunder, J. M., et al. Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese. Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).
- Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes. FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei. J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).
- Gonzalez-Salgado, A., et al. Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth. Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).
- Wu, M., Gerhart, J. Raising Xenopus in the laboratory. Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).
- Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. American clawed frogs. Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).
- Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation. Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).
- Green, S. L. Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis). Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).
- Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).
- Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site. Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).
- Dumont, J. N., Brummett, A. R. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues. J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).
- Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3′,5′-cyclic monophosphate. J Physiol. 352, 551-574 (1984).
- Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides. Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).
- Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function. Neuron. 5, 703-711 (1990).
