Xenopus oocytes: microinjection के लिए अनुकूलित तरीके, कूपिक सेल परतों को हटाने, और electrophysiological प्रयोगों में तेजी से समाधान परिवर्तन
Summary
Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.
Abstract
प्रोटीन के लिए एक heterologous अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में Xenopus oocyte, पहले Gurdon एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। 1 और व्यापक रूप से अपनी खोज के बाद से इस्तेमाल किया गया है (संदर्भ 2 – 3, और संदर्भ उसमें)। एक विशेषता है कि oocyte विदेशी चैनल अभिव्यक्ति के लिए आकर्षक बना देता है अंतर्जात आयन चैनल 4 के गरीब बहुतायत है। यह अभिव्यक्ति प्रणाली कई प्रोटीन, उन्हें ligand-गेटेड आयन चैनल के बीच के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी साबित हो गया।
Xenopus oocytes में गाबा एक रिसेप्टर्स और उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन की अभिव्यक्ति यहाँ वर्णित है, oocytes, Crna, कूपिक सेल परतों को हटाने, और electrophysiological प्रयोगों में तेजी से समाधान परिवर्तन के साथ microinjections के अलगाव भी शामिल है। प्रक्रियाओं इस प्रयोगशाला 5,6 में अनुकूलित और लोगों को नियमित रूप से 7-9 से विचलित इस्तेमाल किया गया था। परंपरागत रूप से, denuded oocytes तैयार कर रहे हैंआरटी पर अंडाशय पालियों की एक लम्बी कोलैजिनेज़ उपचार, और इन denuded oocytes साथ mRNA के साथ microinjected हैं। अनुकूलित विधियों का प्रयोग, विविध झिल्ली प्रोटीन व्यक्त की और इस तरह के पुनः संयोजक गाबा एक रिसेप्टर्स 10-12, मानव पुनः संयोजक क्लोराइड चैनलों 13, trypanosome पोटेशियम चैनलों 14, और एक म्यो -inositol ट्रांसपोर्टर 15, 16 के रूप में इस प्रणाली के साथ अध्ययन किया गया है।
यहाँ विस्तृत तरीकों Xenopus oocytes में पसंद के किसी भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए लागू किया जा सकता है, और तेजी से समाधान परिवर्तन अन्य ligand-गेटेड आयन चैनल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
Xenopus oocytes व्यापक रूप से (- 3, और संदर्भ उसमें संदर्भ 2) एक अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। वे ठीक से इकट्ठा और उनके प्लाज्मा झिल्ली में कार्यात्मक सक्रिय multisubunit प्रोटीन को शामिल करने में सक्षम हैं। इस प्रणाली का उपयोग करना, यह संभव है कार्यात्मक अकेले या अन्य प्रोटीन के साथ संयोजन में झिल्ली प्रोटीन की जांच, उत्परिवर्तित, chimeric, या concatenated प्रोटीन के गुणों का अध्ययन करने के क्रम में, और संभावित दवाओं स्क्रीन करने के लिए।
अन्य heterologous अभिव्यक्ति सिस्टम पर oocytes के प्रयोग के लाभ विशाल कोशिकाओं के सरल हैंडलिंग, विदेशी आनुवंशिक जानकारी, स्नान छिड़काव के माध्यम से oocyte के वातावरण की सरल नियंत्रण व्यक्त कोशिकाओं की उच्च अनुपात, और झिल्ली क्षमता के नियंत्रण में शामिल ।
इस अभिव्यक्ति प्रणाली का दोष यह मौसमी बदलाव के कई प्रयोगशालाओं 17-20 में मनाया जाता है। इस बदलाव के लिए कारणस्पष्ट से दूर है। इसके अतिरिक्त, oocytes की गुणवत्ता अक्सर दृढ़ता से भिन्न करने के लिए मनाया जाता है। पारंपरिक तरीकों 7-9 अंडाशय पालियों के अलगाव, कुछ घंटे के लिए collagenase के लिए अंडाशय पालियों के जोखिम, denuded oocytes का चयन, और oocyte microinjection को शामिल किया है। इधर, विकल्प, तेजी प्रक्रियाओं के एक नंबर सूचित कर रहे हैं कि हमें कोई मौसमी बदलाव और oocyte गुणवत्ता में थोड़ा बदलाव के साथ 30 से अधिक वर्षों के लिए इस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ काम करने के लिए अनुमति दी है।
यहाँ oocytes के अलगाव, Crna साथ microinjection, और कूपिक सेल परतों को हटाने के लिए वर्णित संशोधित और बेहतर तरीकों Xenopus oocyte में पसंद के किसी भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। oocyte आसपास माध्यम के तेजी से समाधान परिवर्तन के लिए बहुत ही सरल विधि किसी भी ligand-गेटेड आयन चैनल की और वाहक के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
तरीकों इस आलेख में वर्णित पारंपरिक रूप से 7-9 इस्तेमाल उन लोगों से विचलित। यह एक 1 से 2 घंटे के कोलैजिनेज़ उपचार से 8 अंडाशय की पालियों को बेनकाब करने के लिए मानक है; undamaged, denuded oocytes को अलग; और उन्हें mRNA वाण?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).
Materials
| NaCl | Sigma | 71380 | |
| KCl | Sigma | P-9541 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| MgSO4 | Sigma | M-1880 | |
| CaCl2 | Sigma | 223560 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma | C1396 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Penicilin/streptomycin | Gibco | 15140-148 | 100 μg penicillin/ml and 100 μg streptomycin/ml |
| Platinum wire loop | home-made | ||
| Micropipette puller | Zeitz-Instruments GmBH | DMZ | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80300 | 10 μl, Type 701N |
| Thick walled polytetrafluoroethylene tubing | Labmarket GmBH | 1.0 mm OD | |
| Paraffin oil | Sigma | 18512 | |
| Nylon net, gauge 0.8 mm | ZBF Züricher Beuteltuchfabrik AG | ||
| Borosilicate glass tube | Corning | 99445-12 | PYREX |
| Collagenase NB Standard Grade | SERVA | 17454 | |
| Trypsin inhibitor type I-S | Sigma | T-9003 | |
| EGTA | Sigma | E3389 | |
| Glass capillary | Jencons (Scientific ) LTD. | H15/10 | 1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0019 | 1.0 OD X 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection) |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus Limited | 30-0044 | 1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp) |
| γ-Aminobutyric acid (GABA) | Sigma | A2129 | |
| 3α,21-Dihydroxy-5α-pregnan-20-one (THDOC) | Sigma | P2016 | |
| grill motor | Faulhaber | DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2 | |
| micrometer screw | Kiener-Wittlin | 10400 | TESA, AR 02.11201 |
| Sterile plastic transfer pipettes | Saint-Amand Mfg. | 222-20S |
References
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