الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

Summary

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Abstract

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introduction

استجابة تكيفية حاسمة لبقاء البكتيريا. من أجل كشف والاستجابة للتغيرات البيئية والبكتيريا استخدام نظام الحوافز والاستجابة المعروفة باسم إشارات مكون اثنين. ^1،2 في نظام ثنائي مكون نموذجي، كيناز الحامض الاميني يكشف حافز وما شابه ذلك، autophosphorylates بقايا لها الحامض الاميني الحفظ، ثم ينقل الفوسفات إلى بقايا اسبارتاتي الحفظ على نطاق الاستقبال من البروتين استجابة منظم. ³ هذا الحدث يؤدي إلى تغيير في نشاط منظم استجابة، مما يحفز تأثير المصب. ^4،5 وهكذا، البكتيريا قادرة على الإحساس والتكيف مع التغيرات في البيئة المحلية. بعض أنظمة إنذار مكون اثنين تحيد عن هذا النموذج الأصلي. في بعض الحالات، المجال الحسي للكيناز الحامض الاميني هو بروتين قائمة بذاتها، الذي يكتشف مباشرة المدخلات الحسية ويعدل النشاط كيناز من خلال تفاعل البروتين البروتين. ^6-8 ومع ذلك، فإن صندوقعملية amental ودورها الشامل للنظام لا يزال هو نفسه. إشارات ثنائي مكون هو نظام الحوافز والاستجابة في كل مكان التي لا غنى عنها لبقاء البكتيريا، وتحركات الحامض الاميني تلعب دورا حاسما في تنبيغ الإشارة. ⁹

وعلى الرغم من أهمية تحركات الحامض الاميني لعلم الأحياء البكتيرية، إلا أنها تظل سيئة تتسم. ويرجع ذلك إلى عدم الاستقرار المتأصل في phosphohistidine، وعدم وجود طريقة عملية لقياس autophosphorylation هذا. Phosphohistidine أكثر عطوب من phosphoserine، phosphothreonine، وphosphotyrosine. ¹⁰ وهكذا، والتقنيات التي تستخدم عادة لتحليل تحركات سر / منتدى المجالس الرومانسية / صور غير قابلة للتطبيق لتحركات الحامض الاميني. وقد اقتصرت عموما ¹¹ في فحوصات المختبر لدراسة تحركات الحامض الاميني لتصوير الإشعاع الذاتي SDS-PAGE. ^12،13 في هذه الطريقة، يتم تحضين [γ- ³² ف] -ATP مع كيناز، ويتم تحليل الفسفرة من كيناز من قبل بولهلام yacrylamide الكهربائي (PAGE) تليها تصوير الإشعاع الذاتي من هلام. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة autophosphorylation كيناز، وكذلك phosphotransfer من كيناز إلى منظم استجابة. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب ملحوظة. فحوصات على أساس PAGE منخفضة الإنتاجية وتستغرق وقتا طويلا. وهذه القيود لا تساعد على تحديد خصائص البروتين والتأكد من المعلمات الحركية. طريقة بديلة لدراسة تحركات الحامض الاميني الذي نشر مؤخرا يستخدم الأجسام المضادة phosphohistidine للكشف عن autophosphorylation. ¹⁴ في حين أن هذا الأسلوب له ميزة التمييز بين 1-phosphohistidine و 3 phosphohistidine، اعتمادا على الأجهزة المستخدمة للكشف، وهذه الطريقة قد لا توفر مجموعة ديناميكية كبيرة أو الحد الأعلى عال من الكشف. وبالتالي، هناك حاجة لفحص أسرع وأقل مشقة، وأكثر حساسية والتي يمكن استخدامها لدراسة هذه البروتينات الهامة.

هنا، نحن تصف ودemonstrate فحص النيتروسليلوز وضعت بعناية ملزم التي يمكن استخدامها لتحديد autophosphorylation من النقاء تحركات الحامض الاميني البكتيرية في المختبر. هذا الاختبار هو أعلى إنتاجية وأقل استهلاكا للوقت من المقايسات القائم على الصفحة. كما يستخدم طريقة إشعاع شيرينكوف لتقدير phosphohistidine، الذي يوفر الحد الأعلى عال من الكشف ومجموعة ديناميكية كبيرة. الفحص يمكن استخدامها لتحديد معالم الحركية للتحركات الحامض الاميني.

Protocol

تحذير: هذا البروتوكول يتطلب التدريب المناسب في استخدام وتداول المواد المشعة. الرجاء استخدام معدات الوقاية الشخصية اللازمة عند إجراء هذا الفحص، بما في ذلك الحماية من الإشعاع بيتا. يجب التعامل مع النفايات المشعة بعناية، كما يتم إنشاء كميات كبيرة من النفايات خلال مرحلة الغسل من ا…

Representative Results

تم إنشاء مجموعة بيانات تمثيلي يضم الصور الملتقطة مع تصوير الفوسفور (الشكل 1)، الشقائقية S صمة عار للغشاء النيتروسليلوز (الشكل 2)، وبيانات عد التلألؤ (الشكل 3). ويبين الشكل 3A الثوابت الحركية الانزيم في مؤامرة خطي?…

Discussion

فحص النيتروسليلوز الملزمة التي وصفناها لديها العديد من المزايا أكثر الأساليب المستخدمة سابقا لوصف تحركات الحامض الاميني. بالمقارنة مع SDS / تصوير الإشعاع الذاتي التقليدي القائم على PAGE، أسلوبنا هو أعلى إنتاجية وأقل استهلاكا للوقت. غشاء النيتروسليلوز هو أسهل للتعامل ?…

Materials

Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose