Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
Адаптивная реакция имеет решающее значение для выживаемости бактерий. В целях выявления и реагирования на изменения в окружающей среде, бактерии используют систему стимула-отклика, известную как сигнализации двухкомпонентной. 1,2 В типичной системе двухкомпонентной, гистидин – киназы обнаруживает родственным стимул, autophosphorylates его законсервированный остаток гистидина, а затем передает фосфат к консервативному остатка аспартата на области приемника белка регулятора ответа. 3 Это событие вызывает изменение активности регулятора ответа, который стимулирует нисходящую эффект. 4,5 Таким образом, бактерии способны чувствовать и адаптироваться к изменениям в местной среде. Некоторые системы сигнализации двухкомпонентные отклоняются от этого архетипа. В некоторых случаях, сенсорная область гистидин-киназы представляет собой автономный белок, который непосредственно обнаруживает сенсорный вход и изменяет активность киназы посредством белок-белкового взаимодействия. 6 – 8 Тем не менее, фондamental процесса и в целом роль системы остается неизменной. Двухкомпонентный сигнализации является повсеместно распространенной системы стимул-отклик, который имеет важное значение для выживаемости бактерий, и гистидинкиназ играют критическую роль в трансдукции сигнала. 9
Несмотря на важность гистидинкиназ к бактериальной биологии, они остаются слабо охарактеризован. Это происходит из-за присущей нестабильности фосфогистидину, а также отсутствие практического метода для измерения аутофосфорилирование. Фосфогистидину более лабильны, чем фосфосерин, фосфотреонина и фосфотирозином. 10 Таким образом, методы, которые обычно используются для анализа Ser / Thr / Tyr киназ не применимы для гистидинкиназ. 11 В пробирке анализы для изучения гистидинкиназ были в значительной степени ограничены SDS-PAGE авторадиографии. 12,13 В этом методе [γ- 32 P] -АТФ инкубируют с киназой, и фосфорилирование киназы анализируют с помощью Polэлектрофорез yacrylamide гель (ПААГ) с последующим авторадиографии геля. Этот метод может быть использован для контроля киназы аутофосфорилирование, а также phosphotransfer от киназы к регулятору ответа. Тем не менее, этот метод имеет значительные недостатки. PAGE на основе анализы низкую пропускную способность и отнимает много времени. Такие ограничения не способствуют характеризации белка и его установления кинетических параметров. Альтернативный метод исследования гистидинкиназ, который был опубликован в последнее время использует фосфогистидину антитела для выявления аутофосфорилирование. 14 В то время как этот метод имеет то преимущество , что различие между 1-фосфогистидину и 3-фосфогистидину, в зависимости от используемой аппаратуры для обнаружения, этот метод не может предложить большой динамический диапазон или высокий верхний предел обнаружения. Таким образом, существует потребность в более короткой, менее трудоемким, и более чувствительного анализа, который может быть использован для изучения этих важных белков.
Здесь мы описываем и demonstrate тщательно разработанной нитроцеллюлозный анализа связывания , который может быть использован для количественного аутофосфорилирование очищенных бактериальных гистидинкиназ в пробирке. Этот анализ является более высокая пропускная способность и меньше времени, чем анализы, основанные на страницах. Метод также использует Черенкова для фосфогистидину количественной оценки, которая предлагает высокий верхний предел обнаружения и большим динамическим диапазоном. Анализ может быть использован для определения кинетических параметров гистидинкиназ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ связывания нитроцеллюлозный мы описали имеет много преимуществ по сравнению с ранее используемыми методами для характеризации гистидинкиназ. По сравнению с традиционными SDS / PAGE на основе авторадиографии, наш метод более высокую пропускную способность и меньше времени. Нитроц…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Департаментом образования при содействии Graduate в районах национальной программы нужны (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
Referências
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Bioquímica. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Bioquímica. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
