ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
適応応答は、細菌の生存のために重要です。検出し、環境変化に対応するためには、細菌は、二成分情報伝達として知られている刺激応答システムを使用しています。典型的な2成分系では1,2は 、ヒスチジンキナーゼは、同族の刺激を検出し、その保存されたヒスチジン残基を自己リン酸化し、その後、応答調節タンパク質のレシーバ・ドメインに保存されたアスパラギン残基にリン酸を転送します。 3このイベントは、下流の効果を刺激するレスポンスレギュレーターの活性の変化を誘発します。 4,5したがって 、細菌は、センスおよびローカル環境の変化に適応することができます。いくつかの二成分シグナリングシステムは、この原型から逸脱します。いくつかのケースでは、ヒスチジンキナーゼの感覚ドメインに直接感覚入力を検出し、タンパク質 – タンパク質相互作用を介してキナーゼ活性を修飾するスタンドアロンのタンパク質です。しかし8、ファンド– 6amentalプロセスおよびシステムの全体的な役割は変わりません。二成分シグナル伝達は、細菌の生存に必須であるユビキタス刺激応答システムであって、ヒスチジンキナーゼは、シグナルの伝達に重要な役割を果たしています。 9
細菌の生物学へのヒスチジンキナーゼの重要性にもかかわらず、彼らは特徴付けが乏しいまま。これは、ホスホの固有の不安定性、および自己リン酸化を測定するための実用的な方法が不足しているためです。ホスホはホスホセリン、ホスホスレオニン、およびホスホチロシンよりも不安定です。 10はこのように、一般にセリン/スレオニン/ Tyrのキナーゼを分析するために使用されている技術は、ヒスチジンキナーゼには適用されません。ヒスチジンキナーゼを研究するためのインビトロアッセイにおいて 、11は、主に SDS-PAGEオートラジオグラフィーに限られていました。 12,13この方法では、[γ-32 P] -ATPをキナーゼとインキュベートし、キナーゼのリン酸化がPOLによって分析されますyacrylamideゲル電気泳動（PAGE）は、ゲルのオートラジオグラフィーを行いました。この方法は、キナーゼの自己リン酸化、ならびにキナーゼからの応答レギュレーターのリン酸転移をモニターするために使用することができます。しかし、この方法では、顕著な欠点があります。ページベースのアッセイは、ロースループットおよび時間がかかります。このような制限は、タンパク質を特徴付けるし、その動態パラメータを確認に資するではありません。最近公開されたヒスチジンキナーゼを研究するための別の方法は、自己リン酸化を検出するためにホスホ抗体を利用します。 14この方法は、検出のために使用した測定方法に応じて、1-ホスホおよび3-ホスホとを区別するという利点を有しているが、この方法は、大きなダイナミックレンジまたは検出の高い上限を提供しない場合があります。したがって、これらの重要なタンパク質を研究するために使用することができるより速く、より少ない労力であり、より高感度のアッセイが必要とされています。
ここでは、説明すると、dインビトロでの精製の細菌ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化を定量化するために使用することができる慎重に開発され、ニトロセルロース結合アッセイをemonstrate。このアッセイは、より高いスループットおよびPAGEベースのアッセイよりも時間がかかります。この方法はまた、検出と大きなダイナミックレンジの高い上限を提供していますホスホ定量化のためのチェレンコフ放射を利用します。アッセイは、ヒスチジンキナーゼの動力学的パラメーターを決定するために用いることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々が説明したニトロセルロース結合アッセイは、ヒスチジンキナーゼを特徴付ける以前に使用されている方法に比べて多くの利点を有しています。従来のSDS / PAGEに基づくオートラジオグラフィーと比較して、我々の方法は、より高いスループットおよびより少ない時間がかかります。ニトロセルロース膜は、SDSゲルよりも取り扱いが容易であり、かつ固定される必要はありません。タンパ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立ニードプログラム（P200A100044）の分野で大学院支援を通じて教育省によってサポートされていました。
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
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