Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
Adaptiv reaktion er afgørende for bakteriel overlevelse. For at opdage og reagere på miljømæssige ændringer, bakterier anvender en stimulus-respons system kaldet to-komponent signalering. 1,2 I en typisk to-komponent system, histidin kinase detekterer et sammenhørende stimulus, autophosphorylates dens konserverede histidinrest, derefter overfører phosphat til en konserveret aspartatresten på receiveren domæne af et responsregulatorprotein protein. 3 Denne begivenhed udløser en ændring i aktiviteten af responsregulatorprotein, som stimulerer en nedstrøms retning. 4,5 Således bakterier er i stand til at sanse og tilpasse sig ændringer i det lokale miljø. Nogle to-komponent signalsystemer afvige fra dette arketype. I nogle tilfælde, den sensoriske domæne af histidin-kinase er en stand-alone-protein, der direkte registrerer sanseindtryk og modificerer kinaseaktivitet gennem en protein-protein-interaktion. 6 – 8 Men fondenamental proces og overordnede rolle systemet forbliver den samme. To-komponent signalering er en allestedsnærværende stimulus-respons, der er afgørende for bakteriel overlevelse og histidin kinaser spiller en kritisk rolle i transduktionen af signalet. 9
Trods betydningen af histidin kinaser til bakteriel biologi, de forbliver dårligt karakteriseret. Dette skyldes den iboende ustabilitet af phosphohistidin, og manglen på en praktisk fremgangsmåde til måling autophosphorylering. Phosphohistidin er mere labilt end phosphoserin, phosphothreonin og phosphotyrosin. 10 Således teknikker, der almindeligvis anvendes til at analysere Ser / Thr / Tyr kinaser er ikke gældende for histidin kinaser. 11 In vitro assays til at studere histidin kinaser er stort set begrænset til SDS-PAGE autoradiografi. 12,13 I denne fremgangsmåde [γ- 32P] -ATP inkuberes med kinase, og phosphorylering af kinasen analyseres ved polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) efterfulgt af autoradiografi af gelen. Denne metode kan anvendes til at overvåge kinase autophosphorylering, samt phosphotransfer fra kinasen til en responsregulatorprotein. Men denne metode har bemærkelsesværdige mangler. PAGE-baserede assays er lille produktion og tidskrævende. Sådanne begrænsninger er ikke befordrende for at karakterisere et protein og fastslå dens kinetiske parametre. En alternativ fremgangsmåde til undersøgelse histidin kinaser, der blev offentliggjort for nylig udnytter phosphohistidin antistoffer til påvisning af autophosphorylering. 14 Selv om denne fremgangsmåde har den fordel, at skelne mellem 1-phosphohistidin og 3-phosphohistidin, afhængigt af den instrumentering, der anvendes til påvisning, kan denne fremgangsmåde ikke tilbyder et stort dynamikområde eller høj øvre detektionsgrænse. Således er der et behov for en hurtigere, mindre arbejdskrævende og mere følsom analyse, der kan bruges til at studere disse vigtige proteiner.
Her beskriver vi og demonstrate en omhyggeligt udviklet nitrocellulose bindingsassay, der kan bruges til at kvantificere autophosphorylering af oprensede bakterielle histidin kinaser in vitro. Denne analyse er højere gennemløb og mindre tidskrævende end PAGE assays. Metoden udnytter også tjerenkovstråling for phosphohistidin kvantificering, som tilbyder en høj øvre detektionsgrænse og et stort dynamisk område. Assayet kan anvendes til at bestemme kinetiske parametre for histidin kinaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nitrocellulosen bindingsassay vi har beskrevet har mange fordele i forhold til tidligere anvendte fremgangsmåder til at karakterisere histidin kinaser. I forhold til traditionelle SDS / SIDE-baserede autoradiografi, vores metode er højere gennemløb og mindre tidskrævende. Nitrocellulosemembranen er lettere at håndtere end SDS-geler, og behøver ikke at være fast. Ponceau farvning nitrocellulosen muliggør proteinpletterne, der skal visualiseres. Dette giver en nem måde at skære hver plet for scintillationstælli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Institut for Uddannelse gennem Graduate bistand på områder af National Need program (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
Referências
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Bioquímica. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Bioquímica. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
