बैक्टीरियल Histidine Kinase Autophosphorylation की मात्रा एक nitrocellulose बाध्यकारी परख का उपयोग
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
अनुकूलनीय प्रतिक्रिया बैक्टीरियल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है। आदेश का पता लगाने और पर्यावरण परिवर्तन के लिए प्रतिक्रिया करने में, जीवाणु एक प्रोत्साहन-प्रतिक्रिया दो घटक संकेत के रूप में जाना जाता प्रणाली का उपयोग करें। 1,2 एक ठेठ दो घटक प्रणाली में, हिस्टिडीन काइनेज एक आत्मीय प्रोत्साहन का पता लगाता है, इसकी संरक्षित हिस्टिडीन अवशेषों autophosphorylates, तो एक प्रतिक्रिया नियामक प्रोटीन का रिसीवर डोमेन पर एक संरक्षित aspartate अवशेषों को फॉस्फेट हस्तांतरण। 3 इस घटना की प्रतिक्रिया नियामक है, जो एक बहाव के प्रभाव को बढ़ावा देने की गतिविधि में एक परिवर्तन हो सके। 4,5 इस प्रकार, बैक्टीरिया भावना और स्थानीय वातावरण में बदलाव के लिए अनुकूल करने में सक्षम हैं। कुछ दो घटक सिगनल प्रणाली इस मूलरूप आदर्श से विचलित। कुछ मामलों में, हिस्टिडीन काइनेज का संवेदी डोमेन एक खड़े अकेले प्रोटीन है, जो सीधे संवेदी इनपुट का पता लगाता है और एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के माध्यम से kinase गतिविधि को संशोधित करता है। 6 – 8 हालांकि, फंडamental प्रक्रिया और प्रणाली के समग्र भूमिका ही रहता है। दो घटक संकेतन एक सर्वव्यापी प्रोत्साहन-प्रतिक्रिया प्रणाली है कि बैक्टीरियल अस्तित्व के लिए आवश्यक है, और हिस्टिडीन kinases संकेत के पारगमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। 9
बैक्टीरियल जीव विज्ञान के लिए हिस्टिडीन kinases के महत्व के बावजूद, वे खराब विशेषता रहते हैं। इस phosphohistidine के निहित अस्थिरता, और autophosphorylation मापने के लिए एक व्यावहारिक विधि की कमी के कारण है। Phosphohistidine से phosphoserine, phosphothreonine, और phosphotyrosine अधिक अस्थिर है। 10 इस प्रकार, तकनीक है कि आमतौर पर Ser / Thr / Tyr kinases विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं हिस्टिडीन kinases के लिए लागू नहीं कर रहे हैं। 11 इन विट्रो assays हिस्टिडीन kinases अध्ययन करने के लिए काफी हद तक एसडीएस पृष्ठ autoradiography तक ही सीमित कर दिया गया है। 12,13 इस विधि में, [γ- 32 पी] -ATP काइनेज साथ incubated है, और काइनेज के फोस्फोराइलेशन पोल से विश्लेषण किया हैyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) जेल के autoradiography द्वारा पीछा किया। इस विधि काइनेज autophosphorylation, साथ ही एक प्रतिक्रिया नियामक को काइनेज से phosphotransfer पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस विधि उल्लेखनीय कमियों है। पृष्ठ आधारित assays कम throughput और समय लेने वाली हैं। ऐसी सीमाओं एक प्रोटीन निस्र्पक और इसकी गतिज मानकों को सुनिश्चित करने के लिए अनुकूल नहीं हैं। हिस्टिडीन kinases अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक तरीका है कि हाल ही में प्रकाशित किया गया था autophosphorylation पता लगाने के लिए phosphohistidine एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है। 14 इस विधि 1-phosphohistidine और 3-phosphohistidine के बीच भेद का लाभ दिया है, वहीं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है, इस पद्धति एक बड़ी गतिशील रेंज या पता लगाने के उच्च ऊपरी सीमा पेशकश नहीं कर सकते। इस प्रकार, वहाँ एक तेजी से, कम श्रमसाध्य है, और अधिक संवेदनशील परख है कि इन महत्वपूर्ण प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए एक की जरूरत है।
यहाँ, हम का वर्णन है और घएक सावधानी से विकसित nitrocellulose बाध्यकारी परख है कि इन विट्रो में शुद्ध बैक्टीरियल हिस्टिडीन kinases के autophosphorylation यों इस्तेमाल किया जा सकता है emonstrate। इस परख उच्च throughput और पृष्ठ आधारित assays से भी कम समय लेने वाली है। विधि को भी phosphohistidine मात्रा का ठहराव है, जो पता लगाने और एक बड़ी गतिशील रेंज के एक उच्च ऊपरी सीमा प्रदान करता है के लिए सेरेन्कोव विकिरण का इस्तेमाल करता है। परख हिस्टिडीन kinases के लिए गतिज मापदंडों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
nitrocellulose बाध्यकारी परख हम वर्णन किया है पहले से इस्तेमाल किया तरीकों पर कई फायदे हिस्टिडीन kinases को चिह्नित करने के लिए है। पारंपरिक एसडीएस / पृष्ठ आधारित autoradiography की तुलना में, हमारे विधि उच्च throughput और कम समय लेन…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय जरूरत कार्यक्रम (P200A100044) के क्षेत्रों में स्नातक की सहायता के माध्यम से शिक्षा विभाग द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
Referências
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