Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
Adaptiv respons er avgjørende for overlevelse av bakterier. For å oppdage og reagere på endringer i miljøet, bakterier bruke en stimulus-respons-system kjent som to-komponent signalering. 1,2 I en typisk to-komponent system, detekterer histidin kinase en beslektet stimulus, autophosphorylates dens konserverte histidin rester, og deretter overfører fosfat til en konservert aspartat rest på mottakeren domene av en reaksjon regulator protein. 3 Dette arrangementet utløser en endring i aktiviteten av responsen regulator, som stimulerer en nedstrøms effekt. 4,5 Således bakterier er i stand til å oppfatte og tilpasse seg endringer i det lokale miljøet. Noen to-komponent signalanlegg avvike fra denne arketypen. I noen tilfeller kan den sensoriske domenet til histidin-kinase er en frittstående protein, som direkte påviser sanseinntrykk og modifiserer kinaseaktivitet gjennom en protein-protein-interaksjon. 6-8 Men fondetamental prosess og generell rolle i systemet forblir den samme. To-komponent-signalering er et allestedsnærværende stimulus-reaksjonssystem som er nødvendig for overlevelse av bakterier, og histidin kinaser spiller en kritisk rolle i transduksjon av signalet. 9
På tross av betydningen av histidin-kinaser bakterielle biologi, de forblir dårlig karakterisert. Dette er på grunn av den iboende ustabilitet av phosphohistidine, og mangelen på en praktisk metode for måling av autofosforylering. Phosphohistidine er mer labil enn fosfoserin-, fosfotreoninmimetikumet, og fosfotyrosin. 10 Dermed teknikker som ofte brukes til å analysere Ser / Thr / Tyr kinaser er ikke aktuelt for histidin kinaser. 11 In vitro-undersøkelser for å studere histidin-kinaser har i stor grad vært begrenset til SDS-PAGE autoradiografi. 12,13 Ved denne metode [γ- 32P] -ATP inkuberes med kinase, og fosforylering av kinase blir analysert ved polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) etterfulgt av autoradiografi av gelen. Denne fremgangsmåten kan brukes til å overvåke kinase autofosforylering, samt fosfor fra kinase til en reaksjon regulator. Imidlertid har denne metoden merkbare feil. HOVED-baserte analyser er lav gjennomstrømning og tidkrevende. Slike begrensninger er ikke bidrar til å karakterisere et protein og å fastslå dens kinetiske parametre. En alternativ metode for å studere histidin-kinaser som ble publisert nylig benytter phosphohistidine antistoffer for påvisning av autofosforylering. 14 Selv om denne metoden har den fordelen av å skille mellom en-phosphohistidine og 3-phosphohistidine, avhengig av instrumenteringen som brukes for deteksjon, denne metoden kan ikke tilby et stort dynamisk område eller høy øvre grense for påvisning. Det er således et behov for en raskere, mindre arbeidskrevende og mer sensitiv analyse som kan brukes til å studere disse viktige proteiner.
Her beskriver vi og demonstrate en nøye utviklet nitrocellulosebindingsanalysen som kan brukes til å kvantifisere autofosforylering av rensede bakterielle histidin-kinaser in vitro. Denne analysen er høyere gjennomstrømning og mindre tidkrevende enn HOVED baserte analyser. Metoden benytter også tsjerenkovstråling for phosphohistidine kvantifisering, som tilbyr en høy øvre grense for deteksjon og et stort dynamisk område. Analysen kan anvendes for å bestemme kinetiske parametere for histidin-kinaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nitrocellulosen bindingsanalysen vi har beskrevet har mange fordeler i forhold til tidligere anvendte metoder for å karakterisere histidin-kinaser. I forhold til tradisjonelle SDS / PAGE-baserte autoradiografi, er vår metode høyere gjennomstrømning og mindre tidkrevende. Nitrocellulosemembranen er lettere å håndtere enn SDS-geler, og behøver ikke å være fast. Ponceau farging av nitrocellulose gjør det mulig for protein flekker å bli visualisert. Dette gir en enkel måte å kutte ut hver spot for scintillasjon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Department of Education gjennom Graduate Assistanse på områder av nasjonal Need program (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
Referências
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Bioquímica. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Bioquímica. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
