Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
Adaptiv respons är avgörande för bakteriell överlevnad. För att upptäcka och reagera på miljöförändringar, bakterier använder en stimulus-respons system som kallas tvåkomponents signalering. 1,2 I ett typiskt två-komponentsystem, detekterar histidin kinas ett besläktat stimulus, autophosphorylates dess konserverad histidinrest, därefter överför fosfat till en konserverad aspartatrest på mottagaren domänen av en svarsregulatorprotein. 3 Denna händelse utlöser en förändring i aktiviteten av svarsregulator, som stimulerar en nedströmseffekt. 4,5 Således bakterier kan känna av och anpassa sig till förändringar i den lokala miljön. Vissa tvåkomponents signalsystem avvika från denna arketyp. I vissa fall är den sensoriska domänen i histidin-kinas en fristående protein, som direkt detekterar sinnesintryck och modifierar kinasaktivitet genom en protein-proteininteraktion. 6-8 Men fondenamental processen och övergripande roll för systemet förblir densamma. Tvåkomponents signalering är en allestädes närvarande stimulus-reaktion som är nödvändig för bakteriell överlevnad, och histidin kinaser spelar en avgörande roll i transduktion av signalen. 9
Trots betydelsen av histidin kinaser till bakteriell biologi, är de fortfarande dåligt karakteriserade. Detta beror på den inneboende instabiliteten hos phosphohistidine, och bristen på en praktisk metod för att mäta autofosforylering. Phosphohistidine är mer labil än fosfoserin, fosfotreonin och fosfotyrosin. 10 Således tekniker som vanligen används för att analysera Ser / Thr / Tyr-kinaser är inte tillämpliga för histidin kinaser. 11 In vitro-analyser för att studera histidin kinaser har i stort sett varit begränsade till SDS-PAGE-autoradiografi. 12,13 I denna metod [γ- 32 P] -ATP inkuberas med kinas och fosforylering av kinaset analyseras genom polyacrylamide gelelektrofores (PAGE) följt av autoradiografi av gelén. Denna metod kan användas för att övervaka kinas autofosforylering liksom phosphotransfer från kinas till en svarsregulator. Emellertid har denna metod märkbara brister. PAGE-baserade analyser är låg genomströmning och tidskrävande. Sådana begränsningar är inte bidrar till att karakterisera ett protein och fastställa dess kinetiska parametrar. En alternativ metod för att studera histidin kinaser som nyligen publicerades utnyttjar phosphohistidine antikroppar för att detektera autofosforylering. 14 Även om denna metod har fördelen av att skilja mellan en-phosphohistidine och 3-phosphohistidine, beroende på instrument som används för detektering, denna metod kanske inte erbjuder ett stort dynamiskt område eller hög övre detektionsgränsen. Det finns således ett behov av ett snabbare, mindre arbetskrävande, och mer känslig analys som kan användas för att studera dessa viktiga proteiner.
Här beskriver vi och demonstrate ett noggrant utvecklade nitrocellulosa bindningsanalys som kan användas för att kvantifiera autofosforylering av renade bakteriella histidin kinaser in vitro. Denna analys är högre kapacitet och mindre tidskrävande än PAGE baserade analyser. Metoden utnyttjar även tjerenkovstrålning för phosphohistidine kvantifiering, som erbjuder en hög övre detektionsgräns och ett stort dynamiskt omfång. Analysen kan användas för att bestämma kinetiska parametrar för histidin kinaser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nitrocellulosabindningsanalysen vi har beskrivit har många fördelar jämfört med tidigare använda metoder för att karakterisera histidin kinaser. I jämförelse med traditionella SDS / PAGE-baserade autoradiografi, är vår metod högre kapacitet och mindre tidskrävande. Nitrocellulosamembranet är lättare att hantera än SDS-geler, och behöver inte vara fast. Ponceau färgning av nitrocellulosa möjliggör protein platser att synliggöras. Detta ger ett enkelt sätt att skära ut varje plats för scintillations…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Institutionen för utbildning genom Graduate stöd inom områden av nationellt behov program (P200A100044).
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
Referências
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Bioquímica. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Bioquímica. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
