bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi
Summary
We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.
Abstract
We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.
Introduction
Adaptif cevap bakteriyel yaşam için çok önemlidir. algılamak ve çevresel değişimlere cevap verebilmek amacıyla, bakteri iki bileşenli sinyalizasyon olarak bilinen bir uyarıcı-tepki sistemi kullanın. Tipik, iki bileşenli bir sistem olarak 1,2, histidin kinaz, ortak kökenli bir uyarıcı tespit onun korunmuş histidin kalıntısı autophosphorylates, o zaman bir yanıt düzenleyici protein, alıcı alan bir korunmuş aspartat artığına fosfat aktarır. 3. Bu olay, bir alt etki uyarır yanıt düzenleyici, aktivitesinde bir değişiklik başlatır. 4,5 Böylece bakteriler duyu ve yerel ortamda değişikliklere uyum edebiliyoruz. Bazı iki bileşenli sinyalizasyon sistemlerin bu arketip sapma. Bazı durumlarda, histidin kinaz duyusal etki doğrudan duyu girişi algılar ve bir protein-protein etkileşimi yoluyla kinaz aktivitesi değiştiren bir tek başına proteinidir. 6 – Ancak 8, fonamental proses ve sistem bütün olarak rolü aynı kalır. İki bileşenli sinyal, bakterinin yaşamda kalması için gerekli olan bir yerde teşvik yanıt sistemi, ve histidin kinazlar sinyal transdüksiyonunda önemli bir rol oynar. 9
Bakteriyel biyoloji histidin kinazlar önemine rağmen, iyi tanımlanmamış kalır. Bu phosphohistidine tabiatında bulunan kararsızlık ve otofosforilasyonunu ölçmek için pratik bir yöntem olmaması kaynaklanmaktadır. Phosphohistidine fosfoserin, fosfotreonin ve fosfotirosin daha hassastır. 10 Böylece, sık Ser / Thr / Tyr kinazlar analiz etmek için kullanılan teknikler histidin kinazlar için geçerli değildir. Histidin kinazlar çalışma 11, in vitro deneyler, büyük ölçüde, SDS-PAGE otoradyografiye sınırlıdır. Bu yöntemde 12,13 [γ- 32P] -ATP kinaz ile kuluçkaya yatırılır, ve kinaz fosforilasyon pol ile analiz ediliryacrylamide jel elektroforezi (PAGE) jelin otoradyografisi eklenmiştir. Bu yöntem, bir yanıt regülatörüne kinaz kinaz otofosforilasyon, hem de phosphotransfer izlemek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli eksiklikleri vardır. PAGE bazlı deneyler, düşük verimlilik ve zaman alıcıdır. Bu tür sınırlamalar bir proteini karakterize ve kinetik parametrelerin ascertaining için elverişli değildir. en son yayınlanan histidin kinazlar çalışmak için alternatif bir yöntem, oto-fosforilasyonunu tespit etmek için phosphohistidine antikorları kullanır. Bu yöntem 1-phosphohistidine ve 3-phosphohistidine arasında ayrım avantajı taşımasının yanısıra, 14 tespiti için kullanılan aletlere bağlı olarak, bu yöntem, bir geniş dinamik aralık veya algılama için yüksek bir üst sınır sağlayamayabilir. Bu nedenle, bu önemli proteinlerin incelemek için kullanılabilir, daha hızlı, daha az zahmetli ve daha hassas analiz için bir ihtiyaç vardır.
Burada, tarif ve din vitro olarak saf halde bir bakteri histidin kinazlar otofosforilasyonu ölçmek için kullanılabilecek bir dikkatle geliştirilmiş nitroselüloz bağlanma tahlili göstermenin. Bu deney, daha yüksek verim ve sayfa tabanlı deneylerde daha az zaman alıcıdır. Yöntem ayrıca algılama ve geniş bir dinamik aralıkta yüksek bir üst sınırı sunan phosphohistidine ölçümü için Cherenkov radyasyon kullanır. Deney histidin kinazlar için kinetik parametreleri belirlemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
daha önce tanımladığımız nitroselüloz bağlanma tahlili histidin kinazlar karakterize etmek için daha önce kullanılan yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Geleneksel SDS / PAGE tabanlı otoradyografi ile karşılaştırıldığında, bizim yöntemi daha yüksek verim ve daha az zaman alıcıdır. Nitroselüloz zar SDS jelleri daha daha kolaydır ve sabit olması gerekmez. protein spotları görüntülenmiştir için nitroselüloz boyama Ponceau sağlar. Bu sintilasyon sayımı için her nokta kesip, ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal İhtiyaç programı (P200A100044) Alanlarında Lisansüstü Yardımlaşma aracılığıyla Milli Eğitim Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Phosphoric acid | VWR | AAAA18067-AP | For quenching reactions and washing nitrocellulose |
| Tris base | RPI | T60040-5000.0 | Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer |
| Potassium chloride | RPI | P41000-2500.0 | For kinase reaction buffer |
| Magnesium chloride | RPI | M24000-500.0 | For kinase reaction buffer |
| Glycerol | RPI | G22020-4000.0 | For kinase reaction buffer |
| 5'-ATP | Promega | E6011 | Kinase substrate |
| [γ-32P]-5'-ATP | Perkin Elmer | NEG002Z250UC | 6000 Ci/mmol |
| 96-well dot blot apparatus | Bio-rad | 1706545 | For spotting reactions |
| Nitrocellulose | Whatman | 32-10401396-PK | For spotting reactions |
| Ponceau S | Sigma aldrich | P3504-50G | For staining nitrocellulose |
Referências
- Stock, A. M., Robinson, V. L., Goudreau, P. N. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 69, 183-215 (2000).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15 (2), 118-124 (2012).
- Parkinson, J. S., Kofoid, E. C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26, 71-112 (1992).
- Laub, M. T., Biondi, E. G., Skerker, J. M. Phosphotransfer profiling: systematic mapping of two-component signal transduction pathways and phosphorelays. Methods Enzymol. 423, 531-548 (2007).
- Ronson, C. W., Nixon, B. T., Ausubel, F. M. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell. 49 (5), 579-581 (1987).
- Szurmant, H., Bu, L., Brooks, C. L., Hoch, J. A. An essential sensor histidine kinase controlled by transmembrane helix interactions with its auxiliary proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (15), 5891-5896 (2008).
- Price, M. S., Chao, L. Y., Marletta, M. A. Shewanella oneidensis MR-1 H-NOX regulation of a histidine kinase by nitric oxide. Bioquímica. 46 (48), 13677-13683 (2007).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Robinson, V. L., Buckler, D. R., Stock, A. M. A tale of two components: a novel kinase and a regulatory switch. Nature Struct. Biol. 7 (8), 626-633 (2000).
- Attwood, P. V., Piggott, M. J., Zu, X. L., Besant, P. G. Focus on phosphohistidine. Amino acids. 32 (1), 145-156 (2007).
- Kee, J. -. M., Muir, T. W. Chasing phosphohistidine, an elusive sibling in the phosphoamino acid family. ACS Chem. Biol. 7 (1), 44-51 (2012).
- Tawa, P., Stewart, R. C. Kinetics of CheA Autophosphorylation and Dephosphorylation Reactions. Bioquímica. 33 (25), 7917-7924 (1994).
- Marina, A., Mott, C., Auyzenberg, A., Hendrickson, W. A., Waldburger, C. D. Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276 (44), 41182-41190 (2001).
- Fuhs, S. R., et al. Monoclonal 1- and 3-Phosphohistidine Antibodies: New Tools to Study Histidine Phosphorylation. Cell. 162 (1), 198-210 (2015).
- Ueno, T. B., Johnson, R. A., Boon, E. M. Optimized assay for the quantification of histidine kinase autophosphorylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (3), 331-337 (2015).
- Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 7 (72), 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Funt, B. L., Hetherington, A. Scintillation counting of beta activity on filter paper. Science. 131 (3413), 1608-1609 (1960).
- Bem, E. M., Bem, H., Reimchüssel, W. Determination of phosphorus-32 and calcium-45 in biological samples by Čerenkov and liquid scintillation counting. Int. J. Appl. Radiat. Isot. 31 (6), 371-374 (1980).
