Quantification des bactéries histidine Kinase autophosphorylation utilisant un dosage nitrocellulose Reliure

Summary

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Abstract

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introduction

réponse adaptative est cruciale pour la survie des bactéries. Afin de détecter et de réagir aux changements environnementaux, les bactéries utilisent un système stimulus-réponse connue sous le nom de signalisation à deux composants. ^1,2 Dans un système à deux composants typique, l'histidine kinase détecte un stimulus apparenté, autophosphoryle son résidu d'histidine conservé, puis transfère le phosphate à un résidu aspartate conservé sur le domaine de récepteur d'une protéine régulatrice de la réponse. ³ Cet événement déclenche un changement dans l'activité du régulateur de réponse, ce qui stimule un effet en aval. ^4,5 Ainsi, les bactéries sont capables de détecter et d' adaptation aux changements dans l'environnement local. Certains systèmes de signalisation à deux composants dévient de cet archétype. Dans certains cas, le domaine sensorielle de l'histidine kinase est une protéine autonome qui détecte directement l'entrée sensorielle et modifie l'activité de la kinase par l'intermédiaire d'une interaction protéine-protéine. ^6-8 Toutefois, le fondsprocessus amental et le rôle global du système reste le même. signalisation à deux composants est un système de stimulus-réponse ubiquitaire qui est essentielle pour la survie des bactéries et histidine kinases jouent un rôle critique dans la transduction du signal. ⁹

Malgré l'importance des histidine kinases à la biologie bactérienne, ils restent mal caractérisés. Ceci est dû à l'instabilité inhérente de phosphohistidine, et l'absence d'une méthode pratique pour la mesure de l'autophosphorylation. Phosphohistidine est plus labile que la phosphosérine, la phosphothréonine et la phosphotyrosine. ¹⁰ Ainsi, les techniques qui sont couramment utilisés pour analyser kinases Ser / Thr / Tyr ne sont pas applicables pour les kinases histidine. ¹¹ essais in vitro pour étudier histidine kinases ont été largement limitée à SDS-PAGE autoradiographie. ^12,13 Dans ce procédé, [γ- ³² P] -ATP est mis en incubation avec la kinase et la phosphorylation de la kinase est analysée par Polélectrophorèse sur gel de yacrylamide (PAGE) suivie par une autoradiographie du gel. Cette méthode peut être utilisée pour surveiller l'autophosphorylation de kinase, ainsi que phosphotransfert de la kinase à un régulateur de réponse. Cependant, cette méthode présente des inconvénients notables. des analyses basées sur PAGE-sont bas débit et de temps. Ces limitations ne sont pas propices à la caractérisation d'une protéine et déterminer ses paramètres cinétiques. Une méthode alternative pour l'étude des histidine kinases qui a été publié récemment, utilise des anticorps pour détecter phosphohistidine autophosphorylation. ¹⁴ Bien que cette méthode a l'avantage de distinguer entre 1-phosphohistidine et 3-phosphohistidine, en fonction de l'instrumentation utilisée pour la détection, cette méthode ne peut pas offrir une large gamme dynamique ou limite supérieure de détection élevé. Ainsi, il existe un besoin pour un test plus rapide, moins pénible et plus sensibles qui peuvent être utilisés pour étudier ces protéines importantes.

Ici, nous décrivons et demonstrate soigneusement mis au point un essai de nitrocellulose de liaison qui peut être utilisé pour quantifier autophosphorylation de kinase histidine bactérienne purifiée in vitro. Ce test est un débit plus élevé et moins de temps que des analyses basées sur PAGE. Le procédé utilise également Cherenkov rayonnement pour phosphohistidine quantification, qui offre une limite supérieure de détection élevée et une grande plage dynamique. Le dosage peut être utilisé pour déterminer les paramètres cinétiques pour histidine kinases.

Protocol

Attention: Ce protocole nécessite une formation appropriée dans l'utilisation et la manipulation de matières radioactives. S'il vous plaît utiliser l'équipement de protection individuelle nécessaire en effectuant ce test, y compris protection contre les rayonnements bêta. Les déchets radioactifs doivent être manipulés avec précaution, car de grandes quantités de déchets sont générés au cours de la phase de lavage de l'expérience. Assurez-vous que les déchets sont stockés dans un récipient en position vert…

Representative Results

Un ensemble de données représentatives a été généré avec une image capturée avec un imageur de phosphore (figure 1), Ponceau S tache de la membrane de nitrocellulose (Figure 2), et les données de comptage de scintillations (figure 3). La figure 3A montre les constantes cinétiques enzymatiques dans une parcelle Lineweaver-Burk. Ces résultats ont été obtenus en utilisant une histidine kinase purifiée à…

Discussion

L'essai de liaison nitrocellulose nous avons décrit présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes précédemment utilisées pour caractériser histidine kinases. En comparaison avec SDS / autoradiographie traditionnel basé PAGE, notre méthode est un débit plus élevé et moins de temps. La membrane de nitrocellulose est plus facile à manipuler que des gels de SDS, et n'a pas besoin d'être réparé. Coloration Ponceau la nitrocellulose permet aux taches protéiques à visualiser. Cela fourni…

Materials

Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose