Pluripotente stamcellen afkomstig van hartcellen voor myocard reparatie
Summary
We presenteren drie nieuwe en efficiëntere protocollen voor differentiatie humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in cardiomyocyten, endotheelcellen en gladde spiercellen en bezorg- de engraftment van getransplanteerde cellen verbetert door het combineren celinjectie met patch-gemedieerde cytokine.
Abstract
Human geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) moet volledig worden onderscheiden in specifieke celtypen voorafgaand aan toediening, maar de conventionele protocollen voor differentiëren hiPSCs in hartspiercellen (iPSC-CMS), endotheelcellen (iPSC-EC), en gladde spiercellen (SMC) zijn vaak beperkt door de lage opbrengst, zuiverheid, en / of slechte fenotypische stabiliteit. Hier presenteren we nieuwe protocollen voor het genereren iPSC-CM, -ECs en -SMCs die aanzienlijk efficiënter dan conventionele methoden, alsmede een werkwijze voor het combineren celinjectie met cytokine-bevattende pleister gemaakt via toedieningsplaats. De patch verbetert zowel de retentie van de geïnjecteerde cellen bij het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van wordt geperst uit het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) over een langere periode. In een warkensmodel van myocardiale ischemie-reperfusieschade, het percentage enting was meer dan twee keer groter is vancellen werden toegediend met cytokine-bevattende pleister vergelijken met de cellen zonder patch, en behandeling met zowel de cellen en de pleister, maar niet de cellen alleen werd geassocieerd met een significante verbetering in hartfunctie en infarctgrootte.
Introduction
Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) behoren tot de meest veelbelovende middelen voor regeneratieve celtherapie omdat ze kunnen worden onderscheiden in een potentieel onbeperkte waaier en de hoeveelheid cellen die niet worden afgewezen door het immuunsysteem van de patiënt. Echter, hun capaciteit voor zelf-replicatie en differentiatie leiden tot tumorvorming en derhalve dient hiPSCs volledig worden onderverdeeld in specifieke celtypen, zoals hartspiercellen (CM), endotheelcellen (ECs) en gladde spiercellen (SMC ), voor toediening. Een van de eenvoudigste en meest voorkomende methoden cel toediening directe intramyocardiale injectie, maar het aantal getransplanteerde cellen die zijn geënt met de natieve myocardiaal weefsel uitzonderlijk laag. Veel van dit verloop kan worden toegeschreven aan de cytotoxische omgeving van het ischemische weefsel; wanneer echter muriene embryonale stamcellen (SER) werden direct geïnjecteerd in het myocardium van niet-beschadigde harten, only ~ 40% van de 5.000.000 cellen geleverd werden behouden gedurende 3-5 uur 1, hetgeen suggereert dat een aanzienlijk deel van de toegediende cellen verlieten de toedieningsplaats, misschien omdat zij uitgeknepen door de naald weg door de hoge drukken die tijdens myocardiale contractie.
Hier presenteren we nieuwe en aanzienlijk efficiëntere werkwijzen voor het genereren iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) 2, endotheliale cellen (EC-iPSC) 3 en gladde spiercellen (SMC) 4. Met name deze iPSC SMC-protocol is de eerste die de uiteenlopende morfologische en functionele kenmerken waargenomen in somatische SMC's 5 door het richten van de cellen naar een overwegend synthetisch of SMC contractiele fenotype nabootsen. Wij ook een werkwijze voor aflevering cel die de engraftment percentage geïnjecteerde cellen verbetert door een cytokine-bevattende fibrine patch op de injectieplaats. De pleister blijkt zowel celretentie verbeteren door het afdichten van de naald weg te voorkomen dat de cellen van het verlaten van het myocardium en celoverleving, door het vrijgeven van insulineachtige groeifactor (IGF) gedurende ten minste drie dagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verbeterde Opbrengst / zuiverheid van iPSC-CM
Gebruikelijke protocollen voor het differentiëren van menselijke stamcellen in CM's zijn vaak beperkt door de lage opbrengst en zuiverheid; bijvoorbeeld, slechts 35-66% van de hESC-CM's verkregen via Percoll scheiding en cardiale vorming lichaam uitgedrukt langzaam myosine zware keten of cTnT 6. De zuiverheid van gedifferentieerde iPSC-CM populatie kan aanzienlijk worden verhoogd door het kiezen voor de expressie van…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
Referências
- Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
- Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
- Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
- Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
- Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
- Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
- Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
- Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
- Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
- Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
- Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
- Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
- Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
