Summary

Плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток сердца для инфарктом Ремонт

Published: February 03, 2017
doi:

Summary

Мы представляем три новых и более эффективных протоколов дифференцировки человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры и способ доставки, который улучшает приживление пересаженных клеток путем объединения инъекции клеток с патч-опосредованной доставки цитокина.

Abstract

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток перед введением, но обычные протоколы для дифференциации hiPSCs в кардиомиоциты (hiPSC-КМВ), эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС), и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) часто ограничена низким выходом, чистотой, и / или плохой стабильности фенотипической. Здесь мы представляем новые протоколы для генерации hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs, которые могут быть значительно более эффективными, чем традиционные методы, а также способ объединения инъекции клеток с цитокинами, содержащий патч, созданный по месту введения. Пластырь улучшает как удерживание инжектированных клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от вытесняют из миокарда и выживаемости клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение длительного периода. В свином модели повреждений миокарда после ишемии-реперфузии, скорость приживления была более чем в два раза больше, когдаКлетки вводили с цитокинами, содержащий пластырь по сравнению с клетками без пластыря, и лечение обоими клетками и пластыря, но не с одним только клетками, было связано со значительным улучшением функции сердца и размера инфаркта.

Introduction

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) являются одними из наиболее перспективных агентов для регенеративной клеточной терапии, потому что они могут быть дифференцированы в потенциально неограниченного круга и количества клеток, которые не отторгаются иммунной системой пациента. Тем не менее, их способность к самовоспроизведению и дифференциации может также привести к образованию опухоли и, следовательно, hiPSCs должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток, такие как кардиомиоциты (КМВ), эндотелиальные клетки (ПАУ) и клеток гладкой мускулатуры (СМЦ ), перед введением. Одним из наиболее простых и наиболее распространенных способов введения клеток является прямым интрамиокардиальной инъекции, но количество трансплантированных клеток, которые привиты нативным ткани миокарда является исключительно низким. Большая часть этого истирания может быть связано с цитотоксической среды ишемизированной ткани; Однако, когда мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) вводили непосредственно в миокарде неповрежденных сердца, оолько ~ 40% из 5 миллионов клеток доставленных были сохранены в течение 3-5 ч 1, что свидетельствует о том , что значительная часть вводимых клеток покинул сайт администрации, возможно , потому , что они были вытеснены через игольное дорожки с помощью высоких давлений , создаваемых в ходе инфаркт сокращение.

Здесь мы представляем новые и значительно более эффективные методы для генерации hiPSC полученных из кардиомиоцитов (hiPSC-КМВ) 2, эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС) 3, и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) 4. Следует отметить, что этот протокол hiPSC-SMC является первым , чтобы имитировать широкий спектр морфологических и функциональных характеристик , наблюдаемых в соматической SMCs 5, направляя клетки к преимущественно синтетическим или сократительной фенотипа SMC. Мы также предлагаем способ доставки клеток, что повышает скорость приживления клеток, инъецированных путем создания цитокинами, содержащей фибрин-рATCH над местом инъекции. Пластырь по-видимому, улучшить и удержания клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от выхода из миокард, и выживаемость клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение по крайней мере трех дней.

Protocol

Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с Руководством животных Университета штата Алабама в Бирмингеме. 1. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-CMs Покрывают лунки 6-луночного планшета с предварительно охлажденный фактора роста сниженном желатиновой белк?…

Representative Results

Характеристика дифференцированной hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs Дифференциальная емкость hiPSCs оценивали 2, 3, 4. Проточная цитометрия анализ экспрессии кардиального тропонина Т (cTnT) свидетельствуют о …

Discussion

Повышение доходности / Чистота hiPSC-CMs

Обычные протоколы для дифференциации человеческих стволовых клеток в CMs часто ограничены низким выходом и чистотой; например, только 35-66% ЭСК-CMs получают путем разделения перколла и формирования сердечной тела выражается медленную тяж…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number Comments
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

Referências

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Play Video

Citar este artigo
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

View Video