Les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique
Summary
Nous présentons trois protocoles nouveaux et plus efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines induites dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses et une méthode de distribution qui permet d'améliorer la prise de greffe de cellules transplantées en combinant l'injection de cellules avec la livraison de cytokines pièce à médiation.
Abstract
Humaines induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSCs) doivent être entièrement différenciées en types de cellules spécifiques avant l'administration, mais des protocoles classiques pour différencier hiPSCs en cardiomyocytes (hiPSC-SGC), les cellules endothéliales (hiPSC-CEs), et les cellules musculaires lisses (CML) sont souvent limitée par un faible rendement, la pureté, et / ou une mauvaise stabilité phénotypique. Ici, nous présentons de nouveaux protocoles pour générer hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs qui sont sensiblement plus efficaces que les méthodes conventionnelles, ainsi qu'une méthode pour combiner l'injection de cellules avec un patch contenant une cytokine créée sur le site de l'administration. Le patch améliore à la fois la rétention des cellules injectées, en obturant la voie de l'aiguille pour empêcher les cellules d'être pressé hors du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), pendant une période prolongée. Dans un modèle porcin d'infarctus lésions d'ischémie-reperfusion, le taux de prise de greffe était plus de deux fois plus élevée lorsque lales cellules ont été administrés avec le patch contenant les cytokines sont comparés aux cellules sans correction, et un traitement avec à la fois les cellules et le patch, mais non avec les cellules seules, a été associée à une amélioration significative de la fonction cardiaque et la taille de l'infarctus.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) sont parmi les agents les plus prometteurs pour la thérapie cellulaire régénérative, car ils peuvent être différenciées en une gamme potentiellement illimitée et la quantité de cellules qui ne sont pas rejetées par le système immunitaire du patient. Cependant, leur capacité d'auto-réplication et la différenciation peut aussi conduire à la formation de tumeurs et, par conséquent, hiPSCs doivent être pleinement différenciées en types de cellules spécifiques, tels que les cardiomyocytes (SGC), les cellules endothéliales (EC), et les cellules musculaires lisses (CML ), avant l'administration. Une des méthodes les plus simples et les plus courantes de l'administration des cellules est l'injection intra-myocardique directe, mais le nombre de cellules transplantées qui sont greffées par le tissu myocardique natif est exceptionnellement bas. Une grande partie de cette attrition peut être attribuée à l'environnement cytotoxique du tissu ischémique; Cependant, lorsque les cellules souches embryonnaires murines (CES) ont été injectés directement dans le myocarde des cœurs indemnes, oeul ~ 40% des 5 millions de cellules livrées ont été retenus pendant 3-5 h 1, ce qui suggère qu'une proportion importante des cellules administrées a quitté le site d'administration, peut – être parce qu'ils ont été évincés par la piste de l' aiguille par les hautes pressions produites au cours de la contraction du myocarde.
Ici, nous présentons des méthodes nouvelles et sensiblement plus efficaces pour générer cardiomyocytes hiPSC dérivés (hiPSC-SGC) 2, les cellules endothéliales (hiPSC-CEs) 3, et les cellules musculaires lisses (CML) 4. Notamment, ce protocole hiPSC-SMC est le premier à imiter le large éventail de caractéristiques morphologiques et fonctionnelles observées dans somatique CML 5 en dirigeant les cellules vers un phénotype SMC essentiellement synthétique ou contractile. Nous fournissons également une méthode de livraison de cellules qui améliore le taux de cellules injectées de greffe en créant un contenant cytokine-fibrine pATCH sur le site d'injection. Le patch semble améliorer à la fois la rétention des cellules, en obturant la voie de l'aiguille pour empêcher les cellules de sortir du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), pendant une période d'au moins trois jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amélioration de rendement / pureté de hiPSC-CMs
protocoles classiques pour la différenciation des cellules souches humaines dans CMs sont souvent limitées par un faible rendement et la pureté; par exemple, juste 35-66% des CSEh-CMs obtenu par Percoll séparation et la formation du corps cardiaque exprimé myosine lente chaîne lourde ou cTnT 6. La pureté des populations hiPSC-CM différenciées peut être sensiblement augmentée en sélectionnant pour l'express…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
Referências
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