Um protocolo para a síntese de 1,2-azaborinas e a preparação de seus complexos proteicos com mutantes de lisozima T4 é apresentado.
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Artigo de método
Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Descrevemos uma síntese geral de 1,2-azaborinas usando técnicas padrão sem ar e preparação de complexo proteico com mutantes de lisozima T4 por difusão de vapor. Os compostos sensíveis ao oxigénio e à humidade são preparados e isolados sob uma atmosfera inerte (N2) utilizando um colector de gases a vácuo ou um porta-luvas. Como exemplo de síntese de azaborina , demonstramos a síntese e purificação do volátil N-H-B-etil-1,2-azabourina por uma sequência de cinco etapas envolvendo destilação e cromatografia em coluna para o isolamento de produtos. Os mutantes L99A e L99A/M102Q da lisozima T4 são expressos com a cepa RR1 de Escherichia coli. Protocolos padrão para lise de células químicas seguidas de purificação usando coluna de troca iônica carboximetil fornecem proteínas de pureza suficientemente alta para cristalização. A cristalização de proteínas é realizada em várias concentrações de precipitante em diferentes faixas de pH usando o método de difusão de vapor de gota suspensa. A preparação complexa com as pequenas moléculas é realizada pelo método de difusão de vapor sob uma atmosfera inerte. A análise de difração de raios-X do complexo cristalino fornece evidências estruturais inequívocas de interações de ligação entre o local de ligação da proteína e as 1,2-azaborinas.
Introdução
Boro-azoto contendo heterociclos (ou seja, 1,2-azaborines) têm atraído recentemente a atenção significativa como is�teros de arenes. Este isosterism pode levar a diversificação dos motivos estruturais existentes para expandir o espaço químico 2, 3, 4. Azaborines ter utilidade potencial para aplicação na investigação biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente na área da química medicinal, em que os químicos realizar a síntese de bibliotecas de m....
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Protocolo
NOTA: Todas as manipulações oxigênio e sensível à humidade foram realizadas sob uma atmosfera inerte (N2), utilizando tanto técnicas livre de ar padrão ou uma caixa de luvas. THF (tetra-hidrofurano), Et2O (éter dietílico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), tolueno, pentano e foram purificados por passagem através de uma coluna de alumina neutra, sob árgon. O acetonitrilo foi seca sobre CaH 2 (de hidreto de cálcio) e destilou-se sob atmosfera de azoto antes de ser utilizado. Pd / C (paládio sobre carbono) foi aquecida sob alto vácuo a 100 ° C durante 12 h antes da utilização. gel de sílica (230-400 mesh) foi seco durante....
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Resultados
A via de síntese para 1,2-esquemática azaborines é mostrado na Figura 1. Isto aplica-se o protocolo para a síntese de cinco moléculas de boro-azoto contendo diferentes. A Figura 2 representa espectros de RMN de 11 B medida no decurso do passo 1.3 para monitorizar a formação do produto desejado (3). Purificação de proteínas foi realizada por cromatografia usando o sistema de baixa pressão e um cromatograma representativo é most.......
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Discussão
Na primeira parte deste protocolo, descrevemos uma síntese modificada de 1,2-azaborines baseados em métodos previamente relatados 12, 13. Triallylborane 22 foi utilizado como um substituto para as rotas usando allyltriphenyl estanho ou de potássio allyltrifluoroborate para preparar N N -allyl- -TBS- B -alil aduto de cloreto de (1). Este método permite uma abordagem mais átomos de-econômica e amb.......
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Divulgações
Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes neste manuscrito.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) e Boston College.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tetrahidrofurano (THF), livre de inibidores, para HPLC, ≥ 99,9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Éter dietílico (Et2O), para HPLC, ≥ 99,9%, livre de inibidores | Sigma Aldrich | 309966 | |
| cloreto de metileno (CH2Cl2), (ACS estabilizado/certificado) | Fisher | D37-20 | |
| Tolueno | Fisher | T290-4 | |
| Pentano, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrila | Fisher | A21-4 | |
| Hidreto de cálcio (CaH2), grau de reagente, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Paládio pirofórico |
| em carvão ativado (Pd/C), 10% em peso Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Solução de tricloreto de boro em hexano | Sigma Aldrich | 211249 | Trietilamina altamente tóxica/pirofórica |
| , ≥ 99,5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs Catalisador < geração >st | materia | C823 | |
| Acetamida | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anidro, 99,8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Solução de etillítio, 0,5 M em benzeno/ciclohexano | Sigma Aldrich | 561452 | altamente tóxico/pirofórico |
| , 2.0 M em Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Metilbutano, anidro, ≥ 99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lisozima WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lisozima mutante (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicilina sal de sódio | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Fosfato de sódio monobásico anidro | Fisher | BP329 | |
| Fosfato de sódio dibásico anidro | Fisher | BP332 | |
| Cloreto de sódio | Fisher | S642212 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Fisher | BP118 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosivo |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Meio de Troca Catiônica de Fluxo Rápido Sepharose | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Azida de sódio | TCI | S0489 | Altamente tóxico |
| 2-Mercaptoetanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartório Concentradores Centrífugos Vivaspin 20 | Fisher | 14-558-501 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hidroxietil dissulfeto | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Tubo de Membrana de Diálise 12.000 a 14.000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | tubulação criogênica em forma de loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | criogênico tong | |
| Coot | Imagens de densidade eletrônica são geradas a partir do software |
Referências
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y.
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Reimpressões e permissões
