Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes

Summary

Um protocolo para a síntese de 1,2-azaborinas e a preparação de seus complexos proteicos com mutantes de lisozima T4 é apresentado.

Abstract

Descrevemos uma síntese geral de 1,2-azaborinas usando técnicas padrão sem ar e preparação de complexo proteico com mutantes de lisozima T4 por difusão de vapor. Os compostos sensíveis ao oxigénio e à humidade são preparados e isolados sob uma atmosfera inerte (N₂) utilizando um colector de gases a vácuo ou um porta-luvas. Como exemplo de síntese de azaborina , demonstramos a síntese e purificação do volátil N-H-B-etil-1,2-azabourina por uma sequência de cinco etapas envolvendo destilação e cromatografia em coluna para o isolamento de produtos. Os mutantes L99A e L99A/M102Q da lisozima T4 são expressos com a cepa RR1 de Escherichia coli. Protocolos padrão para lise de células químicas seguidas de purificação usando coluna de troca iônica carboximetil fornecem proteínas de pureza suficientemente alta para cristalização. A cristalização de proteínas é realizada em várias concentrações de precipitante em diferentes faixas de pH usando o método de difusão de vapor de gota suspensa. A preparação complexa com as pequenas moléculas é realizada pelo método de difusão de vapor sob uma atmosfera inerte. A análise de difração de raios-X do complexo cristalino fornece evidências estruturais inequívocas de interações de ligação entre o local de ligação da proteína e as 1,2-azaborinas.

Introduction

Boro-azoto contendo heterociclos (ou seja, 1,2-azaborines) têm atraído recentemente a atenção significativa como is�teros de arenes. Este isosterism pode levar a diversificação dos motivos estruturais existentes para expandir o espaço químico ^{2, 3, 4.} Azaborines ter utilidade potencial para aplicação na investigação biomédica ^{5, 6, 7, 8,} especialmente na área da química medicinal, em que os químicos realizar a síntese de bibliotecas de m....

Protocol

NOTA: Todas as manipulações oxigênio e sensível à humidade foram realizadas sob uma atmosfera inerte _(N2), utilizando tanto técnicas livre de ar padrão ou uma caixa de luvas. THF (tetra-hidrofurano), _Et2O (éter dietílico), CH ₂ Cl ₂ (diclorometano), tolueno, pentano e foram purificados por passagem através de uma coluna de alumina neutra, sob árgon. O acetonitrilo foi seca sobre CaH ₂ (de hidreto de cálcio) e destilou-se sob atmosfera de azoto antes de ser utilizado. Pd / C (paládio sobre carbono) foi aquecida sob alto vácuo a 100 ° C durante 12 h antes da utilização. gel de sílica (230-400 mesh) foi seco durante....

Results

A via de síntese para 1,2-esquemática azaborines é mostrado na Figura 1. Isto aplica-se o protocolo para a síntese de cinco moléculas de boro-azoto contendo diferentes. A Figura 2 representa espectros de RMN de ¹¹ B medida no decurso do passo 1.3 para monitorizar a formação do produto desejado (3). Purificação de proteínas foi realizada por cromatografia usando o sistema de baixa pressão e um cromatograma representativo é most.......

Discussion

Na primeira parte deste protocolo, descrevemos uma síntese modificada de 1,2-azaborines baseados em métodos previamente relatados ^{12, 13.} Triallylborane ²² foi utilizado como um substituto para as rotas usando allyltriphenyl estanho ou de potássio allyltrifluoroborate para preparar N N -allyl- -TBS- B -alil aduto de cloreto de (1). Este método permite uma abordagem mais átomos de-econômica e amb.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrahidrofurano (THF), livre de inibidores, para HPLC, ≥ 99,9%	Sigma Aldrich	34865
Éter dietílico (Et2O), para HPLC, ≥ 99,9%, livre de inibidores	Sigma Aldrich	309966
cloreto de metileno  (CH2Cl2), (ACS estabilizado/certificado)	Fisher	D37-20
Tolueno	Fisher	T290-4
Pentano, HPLC	Fisher	P399-4
Acetonitrila	Fisher	A21-4
Hidreto de cálcio (CaH2), grau de reagente, 95%	Sigma Aldrich	208027	Paládio pirofórico
em carvão ativado (Pd/C), 10% em peso Pd	Strem	46-1900
1.0 M Solução de tricloreto de boro em hexano	Sigma Aldrich	211249	Trietilamina altamente tóxica/pirofórica
, ≥ 99,5%	Sigma Aldrich	471283
Grubbs Catalisador < geração >st	materia	C823
Acetamida	Sigma Aldrich	A0500
n-Butanol, anidro, 99,8%	Sigma Aldrich	281549
Solução de etillítio, 0,5  M em benzeno/ciclohexano	Sigma Aldrich	561452	altamente tóxico/pirofórico
, 2.0 M em Et2O	Sigma Aldrich	455180
2-Metilbutano, anidro, ≥ 99%	Sigma Aldrich	277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani e Chalmers (ATCC® 31343™)	ATCC	31343
T4 lisozima WT* (L99A)	Addgene	18476
T4 lisozima mutante (S38D L99A M102Q N144D)	Addgene	18477
Ampicilina sal de sódio	Sigma Aldrich	A0166
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	Invitrogen	AM9464
Fosfato de sódio monobásico anidro	Fisher	BP329
Fosfato de sódio dibásico anidro	Fisher	BP332
Cloreto de sódio	Fisher	S642212
Ácido etilenodiaminotetracético	Fisher	BP118
Cloreto de magnésio	Sigma Aldrich	M4880	Corrosivo
Thermo scientific pierce DNaseI	Fisher	PI-90083
GE Healthcare  Meio de Troca Catiônica de Fluxo Rápido Sepharose	Fisher	45-002-931
Tris-base	Fisher	BP152-500
Azida de sódio	TCI	S0489	Altamente tóxico
2-Mercaptoetanol	Fisher	ICN806443
Sartório  Concentradores Centrífugos Vivaspin 20	Fisher	14-558-501
Fosfato de potássio monobásico	Sigma Aldrich	P5379
2-Hidroxietil dissulfeto	Sigma Aldrich	380474
N-paratone	Hampton Research	HR2-643
4 RC Tubo de Membrana de Diálise 12.000 a 14.000 Dalton MWCO	Fisher	08-667E
CryoLoop	Hampton Research		tubulação criogênica em forma de loop
CryoTong	Thermo Fisher		criogênico tong
Coot			Imagens de densidade eletrônica são geradas a partir do software