Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten
Summary
A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.
Abstract
We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.
Introduction
Boron stikstof bevattende heterocyclische verbindingen (dat wil zeggen 1,2-azaborines) hebben onlangs getrokken veel aandacht als isosteren van Arenes. Dit isosterism kan leiden tot diversificatie van bestaande structurele motieven op de chemische ruimte 2, 3, 4 uit te breiden. Azaborines hebben potentiële bruikbaarheid voor toepassing in biomedisch onderzoek 5, 6, 7, 8, vooral op het gebied van medicinale chemie waarin chemici uitvoeren synthese van bibliotheken van structureel en functioneel relevante moleculen. Belangrijk is echter, terwijl er talrijke goed ontwikkelde synthetische routes naar beschikbare areen bevattende moleculen, slechts een beperkt aantal werkwijzen voor de synthese van azaborines gerapporteerd 9, 10, </sup> 11, 12, 13. Dit is voornamelijk te wijten aan een beperkt aantal mogelijkheden voor de boor bron en de lucht- en vocht- gevoelige aard van het molecuul in het vroege stadium van synthetische sequentie.
In het eerste deel van dit artikel zullen we een multi-gram schaal synthese van N -TBS- B-Cl-1,2-azaborine (3) met behulp van standaard lucht-vrije technieken te beschrijven. Deze verbinding dient als een veelzijdig tussenproduct dat verder kan worden gefunctionaliseerd om structureel complexe moleculen 14, 15. Vanaf 3, de synthese en zuivering van N -H- B-ethyl-1,2-azaborine (5) voor gebruik in eiwitbindingsonderzoeken worden beschreven. Vanwege de volatiliteit van 5, zijn efficiënte isolatie vereist een nauwkeurige controle van de reactie temperatuur, tijd, en distgevolgtrekking omstandigheden.
In het tweede deel, protocollen voor eiwitexpressie en isolatie van T4 lysozym mutanten (L99A L99A en / M102Q) 17, 18, 19, 20 worden gepresenteerd, gevolgd door kristallisatie eiwit en bereiding van eiwit-ligand complexen kristal. T4 lysozym mutanten L99A en L99A / M102Q werden gekozen als biologische modelsystemen voor de waterstofbruggen vermogen van NH bevatten azaborine moleculen 17 te onderzoeken. Met behulp van een standaard moleculair biologische protocol wordt het eiwit tot expressie gebracht in Escherichia coli RR1 stam en geïnduceerd met isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Eiwitzuivering wordt uitgevoerd met kolomchromatografie ionenuitwisseling. Eiwit kristallisatie wordt uitgevoerd met sterk geconcentreerde gezuiverde eiwitoplossing (> 95% zuiverheid volgens gelelektroforese) met de hangendedruppel dampdiffusie methode. Vanwege de gevoeligheid van liganden van deze studie zuurstof, zijn de proteïne-ligand complexen bereid onder lucht-vrije omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het eerste deel van dit protocol beschreven we een gemodificeerde synthese van 1,2-azaborines gebaseerd op eerder beschreven werkwijzen 12, 13. Triallylborane 22 werd gebruikt als een substituut voor de routes met behulp van allyltriphenyl tin of kalium allyltrifluoroborate te bereiden N -allyl- N -TBS- B allyl chloride adduct (1). Deze methode zorgt voor een meer atoom-zuinige en milieuvrien…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) and Boston College.
Materials
| Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
| Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
| Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
| Toluene | Fisher | T290-4 | |
| Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
| Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
| Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| 1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
| Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
| n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
| Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
| HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
| isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
| Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
| Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
| Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
| Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| 2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
| CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
| CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
| Coot | Electron density images are generated from the software |
Referências
- Ducruix, A., Giége, R. . Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -. Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
- Wang, X. -. Y., Wang, J. -. Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
- Zhou, H. -. B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
- Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
- Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
- Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
- Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
- White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
- Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
- Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -. Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
- Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -. Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
- Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -. Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
- Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -. Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
- Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
- Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
- Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
- Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Bioquímica. 34 (27), 8564-8575 (1995).
- Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
- Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -. Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
- Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).
