Mitokondrier kan udnytte den elektrokemiske potentiale over deres indre membran (Δ Ψm) til at sekvestrere calcium (Ca2 +), der giver dem mulighed for at forme cytosoliske Ca2 + signalering i cellen. Vi beskriver en fremgangsmåde til samtidig måling mitokondrier Ca2 + uptake og ΔΨ M i levende celler under anvendelse af fluorescerende farvestoffer og konfokal mikroskopi.
Bortset fra deres vigtige rolle i at generere ATP, mitokondrier fungerer også som lokal calcium (Ca2 +) buffere til streng regulering intracellulær Ca2 + -koncentration. For at gøre dette, mitokondrier udnytte elektrokemiske potentiale på tværs af deres indre membran (ΔΨ m) til at udskille Ca2 +. Tilstrømningen af Ca2 + i mitokondrierne stimulerer tre hastighedsbegrænsende dehydrogenaser af citronsyre cyklus, stigende elektronoverførsel gennem den oxidative phosphorylering (OXPHOS) komplekser. Denne stimulering fastholder ΔΨ m, som er midlertidigt spredes som de positive calciumioner krydse den mitokondriske indre membran i den mitokondriske matrix.
Vi beskriver her en metode til samtidig måling mitokondrier Ca 2+ optagelses- og ΔΨ M i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi. Ved permeabilisering af cellerne, mitokondrie Ca2 + kanmåles ved hjælp af den fluorescerende Ca2 + indikator Fluo-4, AM, med måling af ΔΨ m ved hjælp af fluorescerende farvestof tetramethylrhodamin, methylester, perchlorat (TMRM). Fordelen ved dette system er, at der er meget lidt spektral overlapning mellem de fluorescerende farvestoffer, hvilket tillader nøjagtig måling af mitokondrie Ca2 + og ΔΨ m samtidigt. Brug af den sekventielle tilsætning af Ca2 + alikvoter, mitokondriel Ca2 + optagelse kan overvåges, og den koncentration, hvor Ca2 + inducerer mitokondriel membranpermeabilitet overgang og tabet af ΔΨ m bestemmes.
Mitokondrier spiller en vigtig rolle i reguleringen af intracellulære Ca2 + -koncentration ved at fungere som lokale Ca2 + buffere 1. Ca2 + trænger ind i mitokondrierne via Ca2 + uniporter, en proces drevet af den elektrokemiske gradient, der findes i Den mitokondriske indre membran (ΔΨ m) 2. Inde i mitokondrielle matrix, kan Ca2 + aktivere oxidativ phosphorylering ved at stimulere tre hastighedsbegrænsende dehydrogenaser af citronsyre cyklus 3. Denne stimulering fastholder ΔΨ m, som er midlertidigt spredes som de positive calciumioner krydse den mitokondriske indre membran i den mitokondriske matrix. Hvis Ca2 + -koncentration i mitokondrierne bliver meget høj, kan mitokondriel permeabilitetsovergang initieres, hvilket resulterer i spredning af ΔΨ m, den cessation af oxidativ phosphorylering og induktion af celledød signalveje 4.
Den vigtige rolle, mitokondrier spille i den rumlige buffering af cellulær calcium gør nøjagtig overvågning af mitokondrie calcium kritisk. Der er etableret forskellige metoder til at overvåge mitokondrisk calcium, herunder anvendelse af rhodamin- baserede farvestoffer. Et sådant farvestof, Rhod-2, AM, er ganske effektiv til fordeling til mitokondrierne til måling mitochondriske Ca2 + niveau 5, 6. Dog skal man være brugt som nogle farvestof vil akkumulere i andre organeller, såsom liposomer, eller forblive i cellen cytosolen. Ikke desto mindre kan downstream analyser anvendes til at skelne disse signaler fra dem fra mitokondrierne 7.
En anden teknik til at overvåge mitokondrisk calcium anvender fluorescerende reporter-konstruktioner 8 </s op>. Fordelen ved disse genetisk indkodede prober er, at de specifikt kan målrettes mod mitokondrier ved hjælp endogene N-terminale peptider, f.eks targeting signal af human COX subunit VIII N-terminal. Dette system er blevet anvendt til at generere en mitochondrial-målrettet aequorin probe, som har vist sig særdeles nyttig til undersøgelse af mitokondriel calcium signalering 9. Den største ulempe ved disse genetisk indkodede prober er, at de skal indføres i cellerne ved forbigående ekspression (som ikke er mulig for visse celletyper og kan give variable resultater) eller ved at skabe stabile ekspressionssystemer (som er tidskrævende).
For at omgå de ovenfor beskrevne problemer, har vi udviklet en ny protokol til måling af mitokondrie Ca 2+ og ΔΨ m samtidigt. Denne protokol er baseret på en tidligere beskrevet fremgangsmåde, der tilføjer exogent calcium til permeabiliserede cellers = "xref"> 10. Vores protokol har tre fordele frem for andre metoder: For det første bruger vi Fluo-4, AM og TMRM at overvåge mitokondrie Ca 2+ og ΔΨ m, to farvestoffer, der har meget forskellige spektrale egenskaber; dels cellerne permeabiliseret således at Fluo-4 signal kun detektere mitokondriske Ca2 + og ikke Ca2 + lokaliseret til andre organeller eller cellecytosolen; og for det tredje anvendelse af Fluo-4 til at detektere mitokondrisk Ca2 + muliggør hurtig og enkel celle-farvning, at bevirke nogen celle transfektions- eller transformation problemer, der forekommer, hvis hjælp genetisk indkodede prober.
Calcium spiller en kritisk rolle i mange celleprocesser, herunder muskelkontraktion, neuronal signalering og celleproliferation 13. Stigninger i celle calciumkoncentrationer er ofte forbundet med energiefterspørgslen, med calcium i stand til direkte at stimulere mitokondriel oxidativ phosphorylering at hæve ATP generation 3. Det er derfor vigtigt, at vi har evnen til effektivt at overvåge mitokondrie calcium ophobning og at være i stand til at sammenligne, hvordan denn…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Kirstin Elgass og Dr. Sarah Creed fra Monash Micro Imaging til teknisk bistand, og Wellcome Trust og Medical Research Council UK for økonomisk støtte. MMcK understøttes den australske Forskningsråd Future Fellowship Scheme (FT120100459), William Buckland Foundation, The Australian mitokondrie Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research og Monash University. Dette arbejde blev støttet af den victorianske regering Support operationelle infrastruktur Scheme.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
hemacytometer | VWR | 631-0925 |
10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |