Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Summary

Mitokondrier kan udnytte den elektrokemiske potentiale over deres indre membran (Δ _Ψm) til at sekvestrere calcium (Ca2 ^+), der giver dem mulighed for at forme cytosoliske Ca2 ⁺ signalering i cellen. Vi beskriver en fremgangsmåde til samtidig måling mitokondrier Ca2 ⁺ uptake og ΔΨ _M i levende celler under anvendelse af fluorescerende farvestoffer og konfokal mikroskopi.

Abstract

Bortset fra deres vigtige rolle i at generere ATP, mitokondrier fungerer også som lokal calcium (Ca2 ⁺⁾ buffere til streng regulering intracellulær Ca2 ⁺ -koncentration. For at gøre dette, mitokondrier udnytte elektrokemiske potentiale på tværs af deres indre membran (ΔΨ _m) til at udskille Ca2 ^+. Tilstrømningen af Ca2 ⁺ i mitokondrierne stimulerer tre hastighedsbegrænsende dehydrogenaser af citronsyre cyklus, stigende elektronoverførsel gennem den oxidative phosphorylering (OXPHOS) komplekser. Denne stimulering fastholder ΔΨ _m, som er midlertidigt spredes som de positive calciumioner krydse den mitokondriske indre membran i den mitokondriske matrix.

Vi beskriver her en metode til samtidig måling mitokondrier Ca ²⁺ optagelses- og ΔΨ _M i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi. Ved permeabilisering af cellerne, mitokondrie Ca2 ⁺ kanmåles ved hjælp af den fluorescerende Ca2 ⁺ indikator Fluo-4, AM, med måling af ΔΨ _m ved hjælp af fluorescerende farvestof tetramethylrhodamin, methylester, perchlorat (TMRM). Fordelen ved dette system er, at der er meget lidt spektral overlapning mellem de fluorescerende farvestoffer, hvilket tillader nøjagtig måling af mitokondrie Ca2 ⁺ og ΔΨ _m samtidigt. Brug af den sekventielle tilsætning af Ca2 ⁺ alikvoter, mitokondriel Ca2 ⁺ optagelse kan overvåges, og den koncentration, hvor Ca2 ⁺ inducerer mitokondriel membranpermeabilitet overgang og tabet af ΔΨ _m bestemmes.

Introduction

Mitokondrier spiller en vigtig rolle i reguleringen af intracellulære Ca2 ⁺ -koncentration ved at fungere som lokale Ca2 ⁺ buffere ^1. Ca2 ⁺ trænger ind i mitokondrierne via Ca2 ⁺ uniporter, en proces drevet af den elektrokemiske gradient, der findes i Den mitokondriske indre membran (ΔΨ _m) ^2. Inde i mitokondrielle matrix, kan Ca2 ⁺ aktivere oxidativ phosphorylering ved at stimulere tre hastighedsbegrænsende dehydrogenaser af citronsyre cyklus ^3. Denne stimulering fastholder ΔΨ _m, som er midlertidigt spredes som de positive calciumioner krydse den mitokondriske indre membran i den mitokondriske matrix. Hvis Ca2 ⁺ -koncentration i mitokondrierne bliver meget høj, kan mitokondriel permeabilitetsovergang initieres, hvilket resulterer i spredning af ΔΨ _m, den cessation af oxidativ phosphorylering og induktion af celledød signalveje ^4.

Den vigtige rolle, mitokondrier spille i den rumlige buffering af cellulær calcium gør nøjagtig overvågning af mitokondrie calcium kritisk. Der er etableret forskellige metoder til at overvåge mitokondrisk calcium, herunder anvendelse af rhodamin- baserede farvestoffer. Et sådant farvestof, Rhod-2, AM, er ganske effektiv til fordeling til mitokondrierne til måling mitochondriske Ca2 ⁺ niveau ^{5, 6.} Dog skal man være brugt som nogle farvestof vil akkumulere i andre organeller, såsom liposomer, eller forblive i cellen cytosolen. Ikke desto mindre kan downstream analyser anvendes til at skelne disse signaler fra dem fra mitokondrierne ^7.

En anden teknik til at overvåge mitokondrisk calcium anvender fluorescerende reporter-konstruktioner ⁸ </s op>. Fordelen ved disse genetisk indkodede prober er, at de specifikt kan målrettes mod mitokondrier ved hjælp endogene N-terminale peptider, f.eks targeting signal af human COX subunit VIII N-terminal. Dette system er blevet anvendt til at generere en mitochondrial-målrettet aequorin probe, som har vist sig særdeles nyttig til undersøgelse af mitokondriel calcium signalering ^9. Den største ulempe ved disse genetisk indkodede prober er, at de skal indføres i cellerne ved forbigående ekspression (som ikke er mulig for visse celletyper og kan give variable resultater) eller ved at skabe stabile ekspressionssystemer (som er tidskrævende).

For at omgå de ovenfor beskrevne problemer, har vi udviklet en ny protokol til måling af mitokondrie Ca ²⁺ og ΔΨ _m samtidigt. Denne protokol er baseret på en tidligere beskrevet fremgangsmåde, der tilføjer exogent calcium til permeabiliserede cellers = "xref"> 10. Vores protokol har tre fordele frem for andre metoder: For det første bruger vi Fluo-4, AM og TMRM at overvåge mitokondrie Ca ²⁺ og ΔΨ _m, to farvestoffer, der har meget forskellige spektrale egenskaber; dels cellerne permeabiliseret således at Fluo-4 signal kun detektere mitokondriske Ca2 ⁺ og ikke Ca2 ⁺ lokaliseret til andre organeller eller cellecytosolen; og for det tredje anvendelse af Fluo-4 til at detektere mitokondrisk Ca2 ⁺ muliggør hurtig og enkel celle-farvning, at bevirke nogen celle transfektions- eller transformation problemer, der forekommer, hvis hjælp genetisk indkodede prober.

Protocol

1. Forberedelse Celler Grow celler på 10 cm cellekulturskåle eller 75 cm2 kolber i dyrkningsmedier [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 5% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1 x penicillin / streptomycin (P / S )] ved 37 ° C / 5% CO2. At høste celler, fjerne mediet ved aspiration, vask derefter med 5 ml 1x phosphatpufret saltvand (1x PBS). Fjern 1x PBS ved aspiration, hvorefter der tilsættes 1,5 ml 0,25% (vægt / volumen) trypsin / 0,25% (vægt /…

Representative Results

Vi har brugt denne protokol til at undersøge virkningerne af en MT-ND5 mutation på evnen af 143B celle mitokondrier til buffer stigninger i calcium 12. I det viste eksempel blev kontrol 143B-celler fyldt med TMRM og Fluo-4, AM før permeabilisering med digitonin. Efter 5 min på billedbehandling, otte sekventielle tilsætninger af en 1: blev 100 fortynding af 40 mM exogene CaCl2 foretaget, med den endelige frie Ca2 + ionkoncentrati…

Discussion

Calcium spiller en kritisk rolle i mange celleprocesser, herunder muskelkontraktion, neuronal signalering og celleproliferation ^13. Stigninger i celle calciumkoncentrationer er ofte forbundet med energiefterspørgslen, med calcium i stand til direkte at stimulere mitokondriel oxidativ phosphorylering at hæve ATP generation ^3. Det er derfor vigtigt, at vi har evnen til effektivt at overvåge mitokondrie calcium ophobning og at være i stand til at sammenligne, hvordan denn…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641