Summary
Her presenterer vi menneskelige pluripotent stamceller (hPSC) kultur protokoller, som brukes til å skille hPSCs i CD34+ blodkreft progenitors. Denne metoden bruker scenen-spesifikke manipulering av kanoniske WNT signalisering til å angi celler eksklusivt til enten definitive eller primitive blodkreft programmet.
Abstract
En av de viktigste målene for regenerativ medisin er generasjon og vedlikehold av blodkreft stamceller (HSCs) fra menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs). Inntil nylig har arbeidet med å skille hPSCs i HSCs hovedsakelig generert blodkreft progenitors som mangler HSC potensial, og i stedet ligner plommesekken hematopoiesis. Disse resulterende blodkreft progenitors kan ha begrenset nytte for i vitro sykdom modellering av ulike voksen blodkreft lidelser, spesielt de av lymfoide linjen. Imidlertid har vi nylig beskrevet metoder for å generere erythro-myelo-lymfoide multilineage definitive blodkreft progenitors fra hPSCs med en fase-spesifikke rettet differensiering-protokollen, som vi skissere her. Gjennom enzymatisk avstandtagen for hPSCs på kjeller membran matrix-belagte plasticware dannes embryoid organer (EBs). EBs skilles til mesoderm av rekombinant BMP4, som er senere angitt til definitive blodkreft programmet GSK3β inhibitor, CHIR99021. Alternativt angis primitive hematopoiesis av den PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis er videre kjørt gjennom tillegg av rekombinant VEGF og støttende blodkreft cytokiner. Det resulterende blodkreft progenitors generert ved hjelp av denne metoden har potensial til å bli brukt for sykdom og utviklingsmessige modellering, i vitro.
Introduction
Menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs) defineres som omfatter både menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), og har den unike evnen til ikke bare gjennomgår selvtillit fornyelse under aktuelle vekst forhold, men også evnen til å skille ut alle celletyper fra tre bakterie lag: mesoderm og endoderm, og ektoderm1. På grunn av disse unike evner holde hPSCs store løftet for regenerativ medisin, sykdom modellering og cellen-basert behandling2. Mens flere celletyper har vært vellykket differensiert fra hPSCs, er en viktig utfordring i vitro spesifikasjon utelukkende voksen-lignende hPSC-avledet blodkreft stamceller (HSCs) og definitive blodkreft progenitors.
En sannsynlig barriere til utvikling av menneskelige HSCs fra hPSCs er det flere blodkreft programmer innenfor den menneskelige embryo3. Det første programmet som framgår, kalt "primitive hematopoiesis," kommer i extraembryonic eggeplomme sac vevet og er best preget av forbigående produksjonen av erythroblast progenitors (EryP-CFC), makrofager og megakaryocytes. Spesielt dette programmet gi ikke opphav til HSCs eller gjør det gi opphav til T- og B lymfoide progenitors. Men plommesekken transiently gi opphav til begrenset definitive blodkreft progenitors, som erythro-myelogen stamfar (EMP4,5,6,7,8) og erythroid-mangelfull lymfoide primet multipotent stamfar (LMPP9). Men er verken Samkjøringsmodellen eller LMPPs fullt multipotent, eller i stand til HSC-lignende engraftment i voksen mottakere. I kontrast, senere i utviklingen, er klassisk definerte "definitive" blodkreft programmet angitt i regionen aorta-gonad-mesonephros av embryoet riktig, gir opphav til alle voksen blodkreft linjene, inkludert HSC. Spesifikasjon av disse intra embryonale definitive blodkreft cellene oppstår i et hakk avhengig mote, via en endothelial til blodkreft overgang fra hemogenic endotelet (han)3,10,11 ,12,13,14. Bortsett fra rekonstituering kapasitet, kan multilineage potensielle og hakk-avhengighet av disse cellene brukes til å skille disse definitive blodkreft progenitors fra at EMP og LMPP (omtalt i referanser3,13 ).
Forstå mechanism(s) styrer primitive og definitive blodkreft spesifikasjoner fra hPSCs trolig kritiske til at reproduserbar definitive blodkreft progenitors på tvers av en rekke hPSC linjer. Inntil nylig eksisterte hPSC differensiering protokoller som kunne skille multipotent primitive og definitive blodkreft progenitors ikke15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Mange tilnærminger bruker fosterets bovin serum (FBS) og/eller stromal co kultur først beskrevet blodkreft potensialet i hPSC differensiering, med blandinger av primitive og definitive blodkreft potensielle15,16, 17,19,22,23,25. Videre, mange serum-free blodkreft protokoller har beskrevet kravene signal for spesifisering av mesoderm fra hPSCs som havner blodkreft potensielle18,20,21, 24. som disse metodene fortsatt ga opphav til heterogene blandinger av begge programmene, deres bruk i kliniske applikasjoner og forståelse utviklingsmessige mekanismer kan imidlertid være begrenset.
Vi har nylig bygget på disse studiene, har skissert scenen-spesifikke signal kravene til ACTIVIN/NODAL og WNT signalering i primitive og definitive blodkreft spesifikasjonen hPSC-avledet mesoderm18,26 . Sistnevnte var spesielt unik, som bruken av scenen-spesifikke WNT signal manipulasjon gjør at du kan utelukkende primitive eller utelukkende definitive blodkreft progenitors26. Under mesoderm-spesifikasjonen, hemming av kanoniske WNT signalnettverk med PORCN hemmer IWP2 resulterer i spesifikasjon av CD43+ EryP-CFC og myelogen progenitors, med ingen synlig lymfoide potensial. I skarp kontrast stimulering av kanoniske WNT signalnettverk med den GSK3β inhibitor, CHIR99021, under samme scene av differensiering resulterte i den komplette fraværet av synlig CD43+ EryP-CFC, mens samtidig fører til den spesifikasjon av CD34+CD43− han. Denne befolkningen hadde myelogen, HBG-uttrykke erythroid og T-lymfoide potensialet. Etterfølgende analyser identifisert dette var han som manglet uttrykket CD7327,28 og CD18428og dens blodkreft potensial HAKK-avhengige28. Videre, én celle klonal analyser har vist at disse definitive blodkreft linjene kan utledes fra multipotent enkeltceller28. Sammen indikerer disse studier at scenen-spesifikke WNT signalering manipulasjon kan angi rent primitive blodkreft progenitors, eller multipotent HAKK-avhengige definitive blodkreft progenitors.
Her skissere vi vår Differensieringsstrategi som gir utelukkende primitive eller definitive blodkreft progenitors, via manipulering av kanoniske WNT signalering under mesodermal mønstre, og deres nedstrøms blodkreft avstamning analyser. Denne protokollen er av stor verdi for etterforskerne som er interessert i produksjonen av primitive eller definitive blodkreft progenitors fra hPSCs for regenerativ medisin programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser
- motta cellen linjer, hESCs eller hiPSCs 1, mus embryonale fibroblaster (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
- forberedelse av reagenser
- forberede en 0,1% w/v oppløsning av i PBS. Sterilisere av autoklavering og lagre på 4 ° C etter aliquoting.
- Forberede gelatin-belagt plasticware. Coat 6-og retter med 1,5 mL 0,1% gelatin. Inkuber i 15 min ved romtemperatur. Umiddelbart før bruk, Sug opp gjenværende gelatin løsning.
- Forberede MEF media ved å gjøre IMDM med 15% v/v FBS og 1 x antibiotika. Supplere med 2 mM L-glutamin og 400 µM monothioglycerol (MTG) før bruk og lagre på 4 ° C.
- Forberede hPSC kultur media som en løsning av DMEM/F12 med 20% v/v knockout serum erstatning (KOSR), 1 x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1 x antibiotika, 55 µM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin og 10 ng/mL bFGF. Filteret sterilisere med filtere 2 µm og lagre i mørket på 4 ° C.
- Forberede serum-free vask media som DMEM/F12 med 5% v/v KOSR og 4 mM HCl. Filter sterilisere med 2 µm filter, aliquot, og lagre i mørket på 4 ° C.
- Gjør en 1 mg/mL DNase jeg løsningen av oppløsning DNase jeg for 3-4 h i iskalde, sterile deionisert vann på is. Filteret sterilisere med filtere 2 µm og lagre dele på -20 ° C.
- Forberede stopp løsning med vask media: legge til 10% FBS og 10 µg/mL DNase jeg. Stopp løsning bør være forberedt umiddelbart før bruk.
- Forberede kjelleren membran matrix (f.eks, matrigel, referert til som MAT heretter) blanding løsning.
Merk: Alle trinnene forbereder og bruke MATTEN blandingen skal utføres på isen eller 4 ° C. tøvær frossen MAT i isen på 4 ° C over natten. Fortynne MAT 1:1 ved å legge 10 mL iskalde IMDM og chill i isen på 4 ° C over natten. Fortynne MAT blanding med en ekstra 20 mL iskalde IMDM og chill i isen på 4 ° C over natten. Aliquot i pre kjølt rør og butikk på 20 ° C før bruk. Når du er klar til bruk, tine MAT blanding overnatting på 4 ° C.- Pelsen MATTEN celle kultur plater.
Merk: Alle trinn av belegg MAT platene skal utføres på is. Pre chill 6-vel og 24-vel platene på 20 ° C minst 1t. Når du er klar til pels plater, kan du plassere dem på isen. Coat hver brønn med 4 x-utvannet MAT, fjerne og gjenbruke overflødig løsning. La på is 30-60 minutter, og Sug opp overflødig MAT. Tørr MAT belagt plater i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator for minimum 3 h. bruk innen 72 timer av belegg.
- Pelsen MATTEN celle kultur plater.
- Forberede løsning av 10% Bovine Serum Albumin (BSA) ved å løse opp 10% w/v BSA i iskalde, destillert deionisert vann ved 4 ° C i 3-4 h. Filter å sterilisere med en 2 µm filter til en lys-blokkerende flaske og lagre på 4 ° C.
- Forberede askorbinsyre løsningen. Sakte løses en 5 mg/mL løsning av L-askorbinsyre i iskalde, destillert deionisert vann på is 3-4 h. virvel innimellom før oppløst. Filteret sterilisere med filtere 2 µm og lagre dele på -20 ° C.
- Forberede serum-free differensiering (SFD) media ved å lage en løsning av 75:25 av IMDM:Ham ' s F-12, legg deretter til 0,5% BSA, 1 x B27 og 0,5 x N2 kosttilskudd. Butikken på 4 ° C. Legg til 1 x L-glutamin, 50 µg/mL askorbinsyre, 400 µM MTG og 150 µg/mL holo-transferrin umiddelbart før bruke.
- Forberede serum-free stamcelleforskningen kultur medier (f.eks StemPro, referert til som SP34 heretter) per produsenten ' s instruksjoner. Butikken på 4 ° C. Legg til 1 x L-glutamin, 50 µg/mL askorbinsyre, 400 µM MTG og 150 µg/mL holo-transferrin umiddelbart før bruke.
- Forberede 0,2% Collagenase II løsningen ved oppløsning Collagenase II til en siste konsentrasjon av 0,2% w/v i 1:4 FBS:PBS løsning. Oppløse i 37 ° C vannbad i minst 15 min. Filter sterilisere løsning med en 2 µm filter og lagre dele på -20 ° C.
- Forberede fluorescens aktivert celle sortering (FACS) bufferen som en løsning på 5% FBS i IMDM umiddelbart før bruke.
- Forberede OP9 media en løsning av α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-glutamin og 1 x antibiotika. Filteret sterilisere med filtere 2 µm og lagre på 4 ° C.
- Få methylcellulose-basert media (f.eks MethoCult, referert til som MeC heretter) som pre-aliquoted 3 mL mengder eller som en 100 mL flaske. Hvis bruker den 100 mL MeC, ved ankomst, dele inn i 2,5 mL dele i 14 mL konisk rør.
Merk: Alle dele bør lagres på-20 ° C. MeC middels dele bør tines umiddelbart før å bruke.
- forberede en 0,1% w/v oppløsning av i PBS. Sterilisere av autoklavering og lagre på 4 ° C etter aliquoting.
2. Mesoderm differensiering av hPSCs
- vokse hPSC linjer på MEFs til 70-80% confluency, i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
Merk: HPSCs må skarpe, udifferensierte kantlinjer. - Forberede MAT-belagt plasticware 24 timer før passaging hPSCs.
Merk: Antall MAT-belagt 6-og retter varierer over hPSC linjer. Vanligvis er tre 6-vel retter tilstrekkelig per 6-vel rett av confluent hPSCs på MEFs.- Utføre en prøveversjon mater-uttømming med ulike forhold confluent hPSCs:MAT brønner (1:4, 1:3, 1:2, etc.) før den første differensieringen å avgjøre hvor mange MAT-belagt 6-vel retter bør brukes for påfølgende atskillinger.
Merk: 24 timer etter plating på MATTEN, hPSCs bør være 80-90% confluent, med cellen klumper av ca 10-20 celler i størrelse.
- Utføre en prøveversjon mater-uttømming med ulike forhold confluent hPSCs:MAT brønner (1:4, 1:3, 1:2, etc.) før den første differensieringen å avgjøre hvor mange MAT-belagt 6-vel retter bør brukes for påfølgende atskillinger.
- Sug opp hPSC media og legge 1 mL 37 ° C 0,25% Trypsin-EDTA hver godt i 1 leveringstanken og tilsett 1 mL opphøre media hver brønn. Bruker en celle skraper, skrape cellene av platen. Tilsett 1 mL vaskebuffer hver brønn.
- Med en 2 mL serologisk Pipetter, triturate 3 - 5 ganger å bryte opp store klumper av celler og overføre cellene til en 50 mL konisk rør. Sentrifuge hPSCs på 330 x g for 5 min.
- Resuspend cellene i et totalt volum på hPSC media tilsvarende 2 mL per brønn av MAT-belagt plasticware skal brukes. Legg 2 mL/vel i hPSCs til plasticware og ruge over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- 24 timer senere, Sug opp media og erstatte med 37 ° C 0,05% Trypsin-EDTA i 1 Sug opp Trypsin-EDTA og legge 1 mL opphøre media. Skrap cellene kraftig med cellen skraper. Legge til 1 mL vask medier i hver brønn. Med en 2 mL serologisk Pipetter, triturate cellene 1 - 2 ganger og overføre til en 50 mL konisk rør. Sentrifuge celler 220 x g for 5 min.
Merk: Hvor lang tid av Trypsin-EDTA behandling should bestemmes av etterforsker for hver hPSC linje. Trypsin behandling bør brukes så lenge som mulig uten å forårsake encellede dissosiasjon. Dette trinnet skal fjerne alle hPSCs fra MAT-belagt plater, men ikke føre til én celle dissosiasjon. Resulterende EBs skal 6-10 celler, gjennomsnittlig. - Sug opp media. Bruker en 5 mL serologisk Pipetter, forsiktig resuspend cellene i 20 mL vask media. Sentrifuge 220 x g for 5 min.
- Resuspend forsiktig EBs i dag 0 media (tabell 1). Dispensere 2 mL differensiering mediet som inneholder EBs i hver brønn av en 6-og lav-tilhenger celle kultur parabol med en 10 mL serologisk pipetter. Sted i en 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (multi gass) inkubator.
Merk: Dag 0 media: SFD media med 10 ng/mL BMP4 (tabell 1). Bruk en 6-og lav-tilhenger celle kultur rett for hver to plater hPSCs,. - 24 timer senere, legge 2 mL dag 1 medier (tabell 1). Inkuber cellene over natten i en multi gass inkubator.
Merk: Dag 1 media: SFD media supplert med 10 ng/mL BMP4 og 10 ng/mL bFGF i hver brønn (tabell 1). - 18 h senere, forsiktig høste EBs med 5 mL serologisk Pipetter og spinn på 100 x g for 5 min. vask og kombinere hele kultur med 10 mL IMDM. Spinn på 100 x g for 5 min. leveringstanken media.
Merk: Rusk finnes i kulturer. Dette sentrifugering trinnet med lav hastighet (100 x g) vil fjerne rusk. - Resuspend forsiktig EBs i SFD medier med dag 2 media (tabell 1), og deretter dispensere 2 mL per brønn i 6-og lav-tilhenger celle kultur platene. Inkuber i en 37 ° C multi gass inkubator for 30 h.
Merk: Dag 2 media: 10 ng/mL BMP4, og 5 ng/mL bFGF, og den aktuelle WNT Agonistiske eller antagonist (tabell 1).- Legge 3 µM CHIR99021 angi definitive blodkreft progenitors. Også legge til 3 µM IWP2 og 1 ng/mL Activin angi primitive blodkreft progenitors.
- Fortsette å del 3 blodkreft stamfar eksportoppsettet.
3. angivelse av CD34 + blodkreft Progenitors
- etter 30 timer, isolere EBs med en 2 mL serologisk Pipetter på dag 3 av differensiering. Overføre til en 50 mL konisk rør og sentrifuge 330 x g for 5 min. forsiktig resuspend og vask med 10 mL av IMDM. Sentrifuge cellene igjen på 330 x g for 5 min.
- Resuspend EBs i dag 3 media (tabell 2) og dispensere 2 mL i hver brønn av lav-tilhenger 6-og plater. Inkuber celler i en 37 ° C multi gass inkubator for 72 h.
Merk: Dag 3 media: SP34, supplert med 15 ng/mL VEGF og 5 ng/mL bFGF (tabell 2). Legge til flere medier per brønn hvis pH i media høstes på dag 3 av differensiering er betydelig endret (dvs., gul-oransje media). Eller bruk færre EBs per brønn i dag 0. - Etter 72 h med inkubering, tilsett 2 mL dag 6 media (tabell 2) hver brønn. Inkuber i en 37 ° C multi gass inkubator for en ekstra 48 h.
Merk: Dag 6 media: SP34 media med 15 ng/mL VEGF 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 og 50 ng/mL IGF-1 (tabell 2). Hvis flere medier ble lagt til i trinn 3.1, deretter legge tilsvarende beløp for media i trinn 3.2 slik at de siste cytokin konsentrasjonene forblir den samme. - Isolere CHIR99021-behandlet EBs på dag 8 av atskilling. Gå til seksjon 4.
- IWP2-behandlet EBs høstes på dag 8 av differensiering inn i et 50 mL konisk rør. Sentrifuge 330 x g for 5 min. resuspend forsiktig i dag 8 media (tabell 2). Inkuber 24 h i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator lav tilhenger retter. Gå til seksjon 4.
Merk: Dag 8 media: SP34 media med 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L og 30 ng/mL IL-3 (tabell 2).
4. Enzymatisk dissosiasjon av EBs og blodkreft stamfar isolasjon
- isolere EBs med en serologisk Pipetter i en 50 mL konisk rør. Sentrifuge 330 x g for 5 min. leveringstanken av nedbryting.
- Legge til 2 mL 0,25% Trypsin-EDTA EBs. Vortex for 5 s. Incubate i et vannbad 37 ° C for 8 min. legge 5 mL stopp løsning. Sentrifuge 330 x g for 5 min. leveringstanken av nedbryting.
- Resuspend EBs i 5 mL Collagenase II. Vortex 5 s og Inkuber i et 37 ° C vannbad. Etter 60 minutter, vortex 5 s og legge 5 mL av stopp løsning. Spinn på 330 x g for 5 min. leveringstanken av nedbryting.
- I 1 mL av FACS buffer, resuspend cellene. Cellene passere en 40 µm celle sil. Dette fjerner alle undissociated celle klumper.
- Telle celler. Aliquot 1 x 10 6 celler i en 14 mL konisk rør. Spinne cellene på 330 x g for 5 min. Resuspend cellene i en konsentrasjon av 5 x 10 6 celler/mL FACS buffer. Aliquot og basseng 10% av cellene i hver betingelse for flyt cytometric kontroller. Inkuber cellene i antistoffer i 30 min på is, i mørket.
Merk: Se foreslo fluorophore kombinasjoner i Tabellen for materiale.- For IWP2-behandlet celler, bruke anti-CD34 og anti-CD43 antistoffer.
- For CHIR99021-behandlet celler, bruke anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 og anti-CD184 antistoffer.
- Skyll cellene to ganger bruker FACS buffer. Spinn på 330 x g for 5 min. Resuspend cellene på en siste konsentrasjon av 5 x 10 6 celler/mL.
- Analyser eller isolere celler av flowcytometri. For primitiv blodkreft progenitors, analysere den CD34 og CD43 uttrykket ( figur 2A). For endelig blodkreft progenitors, isolere han (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) av FACS ( figur 2B). Samle cellene i rør som inneholder kjølt FACS buffer.
- å vurdere definitive blodkreft potensialet fra isolert han, fortsette å enten seksjon 5 for endothelial til blodkreft overgangen, eller avsnitt 7 for T-lymfoide analysen. Primitive blodkreft CFC analyser, fortsette å del 6.
5. Endothelial til blodkreft overgangen
- Spin den isolerte CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − celler på 330 x g for 5 min. Resuspend celler i han medier på 200.000 celler/mL ( Tabell 2). Distribuere cellene i 50 µL dele i en 96-brønns lav-tilhenger celle kultur plate. Inkuber cellene over natten i en 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gass inkubator.
Merk: Han medier: SP34 media med 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL Angiotensin II og 100 µM Losartan kalium på 2 x 10 5 celler/mL (tabell 2). - Forberede de 24-og MAT-belagt platene (se trinn 1.2.7.1), etter behov.
- Cellene vil samle inn klumper av 6-10 celler over natten. For hvert 50 µL volum av reaggregated celler, forsiktig overføre cellene i midten av en 24-og MAT-belagt plate på neste morgen. Forsiktig plassere plate i 37 ° C multi gass inkubator for 4-6 h, til cellene knyttes.
- Legge til 1 mL av frisk han media i hver brønn, når cellene er knyttet. Inkuber cellene i en 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gass inkubator til blodkreft cellene er synlig (vanligvis 5-7 dager. figur 2D). Visualisere under 100 X forstørrelse med lys mikroskop.
- Høste det definitive blodkreft progenitors av forsiktig fjerne han media fra celler. Dette mediet passere en 40 µm celle sil og samle. På tilhenger cellene i brønnen, Legg til 0,5 mL 0,25% Trypsin-EDTA celler og Inkuber ved 37 ° C i 5 min. Legg til 0,5 mL stopp løsning i hver brønn. Gå gjennom cellene gjennom samme 40 µm celle silen å samle alle tilhenger og ikke-tilhenger sammen. Spinn på 330 x g for 5 min.
- For å vurdere CFC potensialet bulk kultur, fortsette til punkt 6.
- Vask cellene to ganger i FACS buffer. Spinn på 330 x g for 5 min.
- Resuspend cellene i FACS buffer på 5 x 10 6 celler/mL. Stain cellene med anti-CD45 og anti-CD34 antistoffer i 30 min på isen i mørket (foreslått fluorophores er i Tabellen for materiale).
- Vask cellene to ganger i FACS buffer. Spinn på 330 x g for 5 min.
- Isolere CD34 + CD45 + celler av FACS ( figur 2E). Sortere cellene i kjølt FACS buffer.
- Vurdere den definitive CD34 + CD45 + blodkreft progenitors som nødvendig (CFC analysen i punkt 6, lymfoide potensialet i § 7 eller en annen etterforsker startet analysen).
6. CFC analysen
- tine dele MeC for hver prøve brukes for CFC analysen.
- Legge til cellene skal assayed (trinn 4.5, 4.7, 5.5 eller 5.9) i MeC. Vortex grundig og la MeC kulturer står for 5-10 min før luftbobler forsvinne, ifølge produsenten ' s instruksjoner. Med en 16 ½ måle pinne på en 3 mL sprøyte, forsiktig fjerne 2 mL av MeC.
Merk: Typisk plating tettheter spenner fra 1000-20.000 celler/mL, avhengig av forventet stamfar frekvensen. - Nøye, dispensere 1 mL MeC celle blandingen i hver av to 35 mm vev kultur retter. Jevnt distribuere MeC i 35 mm retter ved å forsiktig trykke og rotere parabolen. Plass hver av de ovennevnte rettene i en 15 cm vev kultur fat fylte med vann. Inkuber i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Visualisere MeC kulturer bruker lys mikroskop med 40 X forstørrelse. Kvantifisere de ulike KFK innhentet. Analysere Primitive CFC analyser 8-10 dager etter plating ( figur 2C). Analysere de Definitive CFC analyser 14 dager etter plating. Representant CFC analysen koloni morphologies kan ses i figur 2F.
7. T celle analysen å etablere Definitive blodkreft potensielle
- vokser OP9-DL4 celler til confluent i en 100 mm vev kultur parabol 30 , 31 , 32.
- tøvær OP9-DL4 celler 72-96 h før plating T celle analyser. Resuspend OP9-DL4 cellene i 10 mL OP9 media og støte inn en 10 cm plate. Vokse i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator til 70-90% confluent.
- å høste den OP9-DL4-celler fra en 100 mm rett, Fjern media og legge 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA i 5 min. stoppe trypsin aktiviteten med 5 mL OP9 media. Spinn cellene på 330 x g for 5 min. Resuspend cellene i 1 mL OP9 media og telle celler.
Merk: En 10 cm plate av confluent OP9-DL4-celler vil gi ca 10 x 10 6 OP9-DL4 celler. - 48 timer før T celle analysen, plate 2 x 10 6 celler i 12 mL OP9 medier i en 24-vel rett (0,5 mL/vel). Vokse i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Legge til 2000-10 000 celler å være assayed (som fikk i trinn 4.5, 4.7, 5.5 eller 5.9) 1 godt av OP9-DL4 celler i OP9 medier med: 30 ng/mL SCF (første 6 dager bare), 5 ng/mL IL-7 og 5 ng/mL FLT3-L. ruge i en 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. Ingen medier endringer skjer på dette trinnet.
- Hver 4 - 5 dager, passasje T celle progenitors på fersk OP9-DL4 stromal celler i en 6-vel rett. Triturate cellene med en 1 mL Pipetter og passerer gjennom en 40 µm filter fjerne klumper. Spinn på 330 x g for 5 min. leveringstanken av media. Resuspend cellene i 2 mL av fersk OP9 media supplert med 5 ng/mL IL-7 og 5 ng/mL Flt3-L og sted på fersk OP9-DL4 celler.
Merk: 48 timer før passaging, plate 2 x 10 6 ferske OP9-DL4 celler i 12 mL OP9 media og distribuere 2 mL/godt i 6-vel retter. - Etter minst 21 dager co kultur, triturate cellene kraftig og passerer gjennom et 40 µm filter fjerne celle rusk. Spinn på 330 x g i 5 min og Sug opp nedbryting.
- Vask cellene to ganger i kalde FACS buffer. Spinn på 330 x g for 5 min.
- Resuspend cellene i FACS buffer på 5 x 10 6 celler/mL. Flekk celler med anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 og anti-CD8 antistoffer i 30 min på isen i mørket (foreslått fluorophore er i Tabellen for materiale). Bruke en live/dead celle flekk (DAPI, etc.) for å fjerne rusk fra analysen.
- Vask cellene to ganger i FACS buffer. Spinn på 330 x g for 5 min.
- Analysere celler ved hjelp av en flyt cytometer for å vurdere tilstedeværelsen av T-lymfocytt progenitors ( Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk viser induksjon av primitive og definitive blodkreft progenitors fra hPSCs er illustrert i figur 1. Mesoderm mønstre av kanoniske WNT signalering oppstår i løpet av 2-3 differensiering, etterfulgt av blodkreft stamfar spesifikasjonen.
Representant flyt cytometric analyse og kolonien danner methylcellulose analyser av hPSC-avledet blodkreft differensiering kulturer er vist i figur 2. IWP2-behandlet differensiering kulturer vil gi en distinkt CD34+CD43− og CD34lav /−CD43+ befolkningen, mens CHIR-behandlet differensiering kulturer vil ha < 1% CD43+ celler på dag 8 av differensiering (figur 2AB)26. Primitive blodkreft progenitors stammer under IWP2 forhold isolert på dag 9 vil gi opphav til hovedsakelig primitive erythroid (EryP-CFC) og myelogen progenitors i methylcellulose analyser, mens CHIR-behandlet kulturer er hovedsak uten CFC potensial på dette stadiet (figur 2CF). I stedet CD34+CD43- fra CHIR99021 behandling er en heterogen befolkning, som inneholder endothelial progenitors, samt CD34+CD43-CD73-CD184- () han Figur 2B), som isolert av FACS, først vil danne en monolayer av endothelial-lignende celler (figur 2D, venstre panel), som deretter gjennomgår en endothelial til blodkreft overgang, noe som resulterer i runde, refractile ikke-tilhenger blodkreft cellene (figur 2D, høyre panel). Disse blodkreft cellene kan vurderes av flowcytometri for uttrykk for CD34 og CD45 (figur 2E). Blodkreft progenitors isolert fra EHT analyser kan brukes i methylcellulose analyser og gi opphav til store utbrudd som erythroid colony-forming enheter (BFU-E), liten erythroid colony-forming enheter (CFU-E) og myelogen progenitors (CFU-M. Figur 2F).
Figur 3 viser representant flyt cytometric analyser av T-lymfocytt analyser potensielle fra CHIR99021-avledet CD34+CD43−CD73−CD184− blodkreft progenitors (figur 3A) og IWP2-avledet (figur 3B) CD34+CD43− blodkreft progenitors, etter 21 dager av OP9-DL4 co kultur. Tilstedeværelsen av en CD45+CD56−CD4+CD8+ befolkningen i CHIR-avledet progenitors er veiledende definitive blodkreft potensial i input CD34+ befolkningen. CD34+ og CD43+ progenitors isolert fra IWP2-avledet atskillinger ikke gi opphav til T-lymfocytter i denne analysen, under disse differensiering forhold18,26.
Figur 1: skjematisk diagram av protokollen for spesifikasjon av definitive og primitive blodkreft progenitors. Skildring av eksperimentelle hovedtrinn og tidslinjer av differensiering fra EBs til definitive og primitive blodkreft progenitors. EBs genereres på dag 0 fra hPSCs på MAT-belagt plasticware. EBs dyrkes i SFD mediet som inneholder BMP4 i en multi gass inkubator. På dag 1 av differensiering, er kulturer matet med medier med BMP4 og bFGF. På dag 2 skjer en media endring med WNT manipulasjon gjennom tillegg av CHIR99021 (CHIR) for definitive blodkreft progenitors og IWP2 for primitive blodkreft progenitors. På dag 3 endres media til SP34, supplert med VEGF og bFGF. På dag 6, er kulturer matet med medier med blodkreft cytokiner. På dag 8 av primitive blodkreft spesifikasjonen, media er endret og celler flyttes til en 5% CO2 inkubator for 24 h, etterfulgt av blodkreft stamfar celle (HPC) analysen. På dag 8 av definitive blodkreft spesifikasjonen, CD34+CD43-CD73-CD184- celler er isolert av FACS og assayed for endelig hemogenic endothelial potensialet eller T-lymfoide potensial (ikke avbildet). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av differensiering kulturer og generasjon av primitive blodkreft progenitors. (A) representant flyt cytometric analyser av primitive blodkreft progenitors fra IWP2-behandlet EBs på dag 8. (B) representant flyt cytometric analyser fra CHIR99021-behandlet EBs på dag 8. Hemogenic endotelet (han) kan bli identifisert og isolert som en CD34+CD43-CD73-CD184- befolkningen. (C) Colony-forming potensialet i dag 9 blodkreft progenitors fra IWP2- og CHIR99021 - (CHIR) behandlet differensiering kulturer. n = 3, feilfelt representerer SD for gjennomsnittet, stjernene indikerer statistisk betydning, ved hjelp av student t-test *** p < 0,0001. (D) representant fotografier av isolerte han cellene etter 4 dager (venstre) eller 7 + dager (høyre) vekst på MAT-belagt plasticware. Opprinnelige visningsstørrelsen, 100 X. Skalere barer = 100 µm. (E) representant flowcytometri CD34 og CD45 uttrykk fra definitive blodkreft progenitors etter 9 dager kultur. (F) representativt bilde viser morfologi av EryP-CFC (venstre), CFU-M (midten), BFU-E og CFU-E (høyre). Opprinnelige visningsstørrelsen, 40 X. Skalere barer = 100 µm. piler indikerer navnet kolonier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av definitive blodkreft potensial. Representant flyt cytometric analyser av T lymfocytt potensialet i CHIR-avledet CD34+CD43−CD73−CD184− blodkreft progenitors (A) eller IWP2-avledet (B) CD34+CD43 − blodkreft progenitors, 28 dager etter co kultur med OP9-DL4 celler. T-lymfocytt potensialet fra et utvalg anses positiv hvis det er mer enn 100 CD45+ hendelser oppdaget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: SFD-baserte medier for dager 0 - 2.
| SP34 Media | Dag 3 | Dag 6 | Dag 8 | HAN |
| VEGF | 15 ng/mL | 15 ng/mL | - | 5 ng/mL |
| bFGF | 5 ng/mL | 5 ng/mL | - | 5 ng/mL |
| SCF | - | 200 ng/mL | 100 ng/mL | 100 ng/mL |
| EPO | - | 4 IU | 2 IU | 2 IU |
| IL-6 | - | 20 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-11 | - | 10 ng/mL | 5 ng/mL | 5 ng/mL |
| IGF-1 | - | 50 ng/mL | 25 ng/mL | 25 ng/mL |
| TPO | - | - | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| Flt - 3L | - | - | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-3 | - | - | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| BMP4 | - | - | - | 10 ng/mL |
| HYSJ | - | - | - | 20 ng/mL |
| Angiotensin II | - | - | - | 10 µg/mL |
| Losartan kalium | - | - | - | 100 ΜM |
Tabell 2: SP34-baserte medier for dager 3 - 8, og han.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en rask, serum-free, stroma-fri metode for differensiering av primitive eller definitive blodkreft progenitors. Mesodermal spesifikasjon av primitive eller definitive blodkreft progenitors kan bli pålitelig oppnådd med våre protokollen, som unikt utnytter lite molekyl hemmere kanoniske WNT signalnettverk. Scenen-spesifikke WNT aktivering av GSK3β hemmer CHIR9902133 gir opphav til definitive blodkreft mesoderm, mens WNT hemming av PORCN hemmer IWP234 angir primitive blodkreft mesoderm26. Av notatet gir denne metoden ikke robust opphav til en engraftable HSC-lignende befolkning (vises ikke). Men er det definitive blodkreft progenitors generert med denne tilnærmingen mottakelig for transgene-indusert engraftment potensielle35, merking av deres potensielle i fremtidige translasjonsforskning programmer.
En viktig determinant til vellykket hPSC differensiering er den opprinnelige størrelsen til EBs som er dannet av hPSCs. Ideelt sett EBs bør være rundt 6-10 celler i størrelse. Differensiering kulturer kan aberrantly angi en blanding av begge programmene hvis EBs er for stor, muligens på grunn av feil signal aktivering innen EB. Differensiering kulturer bør utsettes for optimal EB størrelse innen de første 24 timer av differensiering. Alternativt, hvis hPSCs er helt atskilt til enkeltceller, hPSCs i stedet gjennomgå anoikis celle død36, noe som resulterer i dårlig blodkreft differensiering.
En vellykket differensiering vil gi opphav til utelukkende primitive blodkreft progenitors når IWP2 brukes under mesodermal spesifikasjonen på dager 2 og 3 i denne differensiering-protokollen. På dag 8 av atskilling, IWP2-avledet kulturen bør bestå av forskjellige CD34+CD43−, CD34Middels/lavCD43+, og CD34−CD43+ bestander (figur 2A). CD34Middels/lavCD43+ befolkningen gir opphav til primitive erythroid og myelogen progenitors; mens CD34−CD43+ befolkningen hovedsakelig gir opphav til erythroid progenitors med begrenset myelogen potensielle18. Primitive blodkreft potensial kan bekreftes av methylcellulose analysen for tilstedeværelsen av EryP-CFC (del 6), som vil hovedsakelig express embryonale globin HBE i forhold til fosterets HBG26, 28,37. Tilsvarende tilstedeværelsen av CD43+ blodkreft progenitors på dette stadiet kan sikkert brukes til å indikere tilstedeværelse av primitive blodkreft progenitors18,23,26. Det bør bemerkes at CD43 uttrykk er ikke eksklusivt til progenitors av primitive blodkreft programmet18,23,26, og kan ikke brukes som eneste beregning for å vurdere primitive blodkreft potensial, som immunophenotype og HAKK-avhengighet av menneskelige EMP forblir uncharacterized (omtalt i3).
Når CHIR99021 brukes under mesodermal mønstre i løpet av dager 2 og 3 av differensiering, angis en befolkning på utelukkende definitive blodkreft progenitors. På dag 8 av atskilling protokollen, CHIR99021-avledet kulturer bør bestå av en særegen CD34+CD43− befolkningen, med liten eller ingen CD43 uttrykk26. CD34+CD43− befolkningen er en heterogen befolkning av endotelceller med blodkreft venøs og arteriell potensial som kan avgrenses basert på CD73 og CD184 uttrykk, med han celler mangler uttrykk for begge 27,28. Når endelig han er isolert etter under et HAKK-avhengige endothelial til blodkreft overgang (del 5)28 vil det gi CD34+CD45+ blodkreft progenitors som vil gi opphav til BFU-E og myeloide celler i methylcellulose, men ikke EryP-CFC26,28 (figur 2). I tillegg BFU-E kolonier kan være isolert og vurdert for globin analyse, som vil hovedsakelig express føtal globin HBG i forhold til embryonale HBE (vises ikke)26,28, 37. derimot lymfoide potensialet direkte kan vurderes fra isolert han som HAKK-avhengige endothelial til blodkreft overgangen skjer på28stroma18,26,OP9-DL4. Den endelige han angitt med denne metoden inneholder erythro-myelo-lymfoide progenitors på en klonal nivå28, som funksjonelt skiller det fra vår nåværende forståelse av EMP eller LMPP progenitors3. Som sådan, T-lymfoide og HBG-uttrykke erythroid potensial, kombinert med et fravær av EryP-CFC potensial, kan brukes til å angi pålitelig definitive blodkreft spesifikasjonen fra hPSCs. Av notatet, utelukkende vurdering for progenitors som kan gi opphav til HBG-uttrykke erythroblasts kanskje ikke nøyaktig fastslå definitive potensialet, som ligner som beskrevet ovenfor, den menneskelige EMP og signal kravene, har ikke vært preget til dags dato (omtalt i referanse3).
Denne enkle differensiering strategien er svært kraftig som gjør det mulig for generering av utelukkende primitive eller utelukkende definitive blodkreft progenitors, slik at sykdommen modellering komparative studier av de to programmene fra pasient-avledede iPSCs eller genet endret hPSCs. Tilsvarende kan menneskelig utviklingsprosesser bli avhørt, som å oppdage hva ekstra signal pathway(s) kreves for å tildele selvtillit fornyelse kapasitet og dermed HSC-lignende potensial, fra den definitive blodkreft forfedre.
Oppsummert WNT manipulasjon under mesodermal mønstre i hPSCs angir primitive CD43+ eller definitive CD34+CD45+ blodkreft progenitors, som kan være isolert og brukes til å studere hPSC-avledet hematopoiesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet har blitt støttet av Institutt for indremedisin, divisjon av hematologi, Washington University School of Medicine. CD ble støttet av T32HL007088 fra nasjonale hjerte, lunge og blod Institute. CMS ble støttet av en American Society for hematologi Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
