Summary
Här presenterar vi mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) kultur-protokoll, används för att differentiera hPSCs in CD34+ hematopoetiska progenitorceller. Denna metod använder scenen-specifika manipulation av kanoniska WNT signalering ange celler uteslutande att antingen slutgiltig eller primitiva hematopoetiska program.
Abstract
En av de stora målen för regenerativ medicin är generation och underhåll av hematopoetiska stamceller (Förenta) härrör från mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs). Tills nyligen har ansträngningar differentieras hPSCs till Förenta huvudsakligen genererat hematopoetiska progenitorceller som saknar HSC potential, och istället likna gulesäcken blodbildning. Dessa resulterande hematopoetiska progenitorceller kan ha begränsad nytta för in vitro- sjukdom modellering av olika vuxna hematopoetiska störningar, särskilt de av de lymfoida härstamningar. Vi har dock nyligen beskrivit metoder för att generera erythro-myelosuppression-lymfoida Multilinjärt slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller från hPSCs med en stage-specifika riktad differentiering-protokollet, som vi beskriver här. Genom enzymatisk dissociation av hPSCs på basalmembranet matrix-belagda plasticware bildas embryoid organ (EBs). EBs särskiljs till mesoderm av rekombinant BMP4, som därefter anges till slutgiltig hematopoetiska programmet av den GSK3β-hämmaren, CHIR99021. Alternativt, primitiva blodbildning anges av den PORCN-hämmaren, IWP2. Blodbildning drivs vidare genom tillägg av rekombinant VEGF och stödjande hematopoetiska cytokiner. De resulterande hematopoetiska progenitorceller genereras med den här metoden har potential att användas för sjukdom och utvecklingsmässiga modellering, in vitro.
Introduction
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) definieras som omfattar både mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), och har den unika funktionen av inte bara genomgå självförnyelse under lämpliga odlingsbetingelser, men också förmåga att differentieras till alla celltyper härrör från de tre groddar skikt: endoderm, mesoderm och ektoderm1. På grund av dessa unika förmågor hålla hPSCs stort löfte för regenerativ medicin, sjukdom modellering och cellbaserade terapier2. Medan flera celltyper har varit framgångsrikt differentierade från hPSCs, är en betydande utmaning specifikationen i vitro endast vuxen-liknande hPSC-härrör hematopoetiska stamceller (Förenta) och slutgiltig hematopoetiska progenitorceller.
Ett sannolikt hinder för utvecklingen av mänskliga Förenta från hPSCs är förekomsten av flera hematopoetiska program inom det mänskliga embryo3. Det första programmet som framträder, kallas ”primitiva blodbildning”, påbörjar inom embryoniskt gulesäcken vävnaden och är bäst kännetecknas av övergående produktion av erytroblast stamfäder (EryP-CFC), makrofager och megakaryocyter. Bland annat detta program ger inte upphov till Förenta, inte heller ger det upphov till T- och B lymfoida stamfäder. Gulesäcken ger dock övergående upphov till begränsad slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller, såsom den erythro-myeloida stamceller (EMP4,5,6,7,8) och den erytroid-brist lymfoida-primade multipotenta stamceller (LMPP9). Men är varken EMPs eller LMPPs fullt multipotenta eller kan HSC-liknande engraftment i vuxna mottagare. Däremot senare i utvecklingen anges klassiskt definierade ”slutgiltiga” hematopoetiska programmet i regionen aorta-gonad-mesonephros av embryot korrekt, ger upphov till alla vuxna hematopoetiska härstamningar, inklusive HSC. Specifikationen av dessa inom embryonala slutgiltiga hematopoetiska celler uppstår i en Notch-beroende mode, via en endothelial-till-hematopoetiska övergång från hemogenic endotel (han)3,10,11 ,12,13,14. Bortsett från beredning kapacitet, kan den multilineage potentiella och Notch-beroende av dessa celler användas att skilja dessa slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller från EMP och den LMPP (recenserade i referenser3,13 ).
Förstå de mekanismerna som reglerar primitiva och slutgiltiga hematopoetiska specifikation från hPSCs är sannolikt kritisk till reproducerbara produktionen av slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller över en mängd olika hPSC linjer. Tills nyligen, fanns hPSC differentiering protokoll som kunde avskilja multipotenta primitiva och slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller inte15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Många metoder först med fetalt bovint serum (FBS) eller stromal samtidig kultur beskrivs hPSC differentiering, hematopoetiska potential med blandningar av primitiva och slutgiltiga hematopoetiska potentiella15,16, 17,19,22,23,25. Vidare, många serumfritt hematopoetiska protokoll har beskrivit signal kraven för specifikation av mesoderm från hPSCs som hamnar hematopoetiska potentiella18,20,21, 24. eftersom dessa metoder gav ändå upphov till heterogena blandningar av båda programmen, deras användning i kliniska tillämpningar och förståelse utvecklingsmässiga mekanismer kan dock begränsas.
Vi har nyligen byggt på dessa studier, har beskrivits scenen-specifik signal kraven för ACTIVIN/NODAL och WNT signalering i primitiva och slutgiltiga hematopoetiska specifikation från hPSC-derived mesoderm18,26 . Den senare var särskilt unik, eftersom dess användning av scenen-specifika WNT-signal manipulering möjliggör specifikation av antingen uteslutande primitiva eller uteslutande slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller26. Under mesoderm specifikation, hämning av kanoniska WNT signalering med PORCN-hämmaren IWP2 resulterar i specifikationen av CD43+ EryP-CFC och myeloida med inga detekterbara lymfoida potential. I skarp kontrast, stimulering av kanoniska WNT signalering med GSK3β-hämmaren CHIR99021, under samma skede i differentiering resulterade i en total avsaknad av detekterbara CD43+ EryP-CFC, medan samtidigt leder till den specifikation av CD34+CD43− han. Denna population besatt myeloisk, HBG-uttrycker erytroid och T-lymfoida potential. Efterföljande analyser identifierat detta han saknas uttryck för CD7327,28 och CD18428, och dess hematopoetiska potential var NOTCH-beroende28. Ytterligare, encelliga klonal analyser visat att dessa slutgiltiga hematopoetiska härstamningar kan härledas från multipotenta enstaka celler28. Sammantaget tyder dessa studier på att scenen-specifika WNT signalering manipulation kan ange antingen ren primitiva hematopoetiska progenitorceller, eller multipotenta NOTCH-beroende slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller.
Här beskriver vi vår differentiering strategi som ger uteslutande primitiva eller slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller, via manipulation av kanoniska WNT signalering under mesodermala mallning och deras nedströms hematopoetiska härstamning analyser. Detta protokoll är av stort värde att utredare som är intresserade av produktionen av antingen primitiva eller slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller från hPSCs för regenerativ medicin program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser
- Hämta cell linjer; hESCs eller hiPSCs 1, mus embryonala fibroblaster (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
- REAGENSBEREDNING
- förbereda en 0,1% w/v lösning av gelatin i PBS. Sterilisera i autoklav och förvaras vid 4 ° C efter alikvotering.
- Förbereda den gelatin-belagd plasticware. Kappa 6-bra rätter med 1,5 mL 0,1% gelatin. Inkubera i 15 min i rumstemperatur. Sug ut återstående gelatin lösningen omedelbart före användning,.
- Förbered MEF genom att göra IMDM med 15% v/v FBS och 1 x antibiotika. Komplettera med 2 mM L-glutamin och 400 µM monothioglycerol (MTG) före användning och förvaras vid 4 ° C.
- Förbereder hPSC kultur media som en lösning av DMEM/F12 med 20% v/v knockout serum ersättning (KOSR), 1 x icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1 x antibiotika, 55 µM β-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin och 10 ng/mL bFGF. Filter för att sterilisera med 2 µm filter och förvaras i mörker vid 4 ° C.
- Förbereda den serumfritt Wash media som en lösning av DMEM/F12 med 5% v/v KOSR och 4 mM HCl. Filter för att sterilisera med 2 µm filter, alikvotens, och förvaras i mörker vid 4 ° C.
- Göra en 1 mg/mL DNAS jag lösning genom att lösa DNAS jag för 3-4 h i iskall, sterilt avjoniserat vatten på isen. Filter för att sterilisera med 2 µm filter och lagra alikvoter vid -20 ° C.
- Bereda stopplösning med WASH media: lägga till 10% FBS och 10 µg/mL DNAS jag. Stopplösningen ska beredas omedelbart före användning.
- Förbereda basalmembranet matrix (t.ex., matrigel, kallad matta härefter) blandning lösning.
Obs: Alla åtgärder förbereder och med matta blandningen ska utföras på is eller vid 4 ° C. Tina frusna matta i isen vid 4 ° C över natten. Späd matta 1:1 genom att tillsätta 10 mL iskallt IMDM och chill i isen vid 4 ° C över natten. Späd matta blandning med ytterligare 20 mL iskallt IMDM och chill i isen vid 4 ° C över natten. Delprov i förväg kylda rör och förvaras vid-20 ° C fram till användning. När du är klar för användning, Tina matta blandning över natten vid 4 ° C.- Coat mattan cell kultur plattor.
Obs: Alla steg av beläggning matta plattor bör utföras på is. Pre chill 6-väl och 24, väl plattor vid-20 ° C i minst 1 h. När redo att coat plattor, placera dem på isen. Täck varje brunn med 4 x utspädda matta, ta bort och återanvända eventuellt överskott av lösning. Lämna på is för 30-60 min och aspirera överflödig matta. Torka MAT belagda plattorna i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator för minst 3 h. användning inom 72 h beläggning.
- Coat mattan cell kultur plattor.
- Bereda lösning 10% bovint serumalbumin (BSA) genom upplösning 10% w/v BSA i iskall, destillerat avjoniserat vatten vid 4 ° C för 3-4 h. Filter att sterilisera med 2 µm filter i en ljus-blockerande flaska och butik vid 4 ° C.
- Bered den ascorbic syra. Långsamt lös en 5 mg/mL lösning av L-Askorbinsyra i iskall, destillerat avjoniserat vatten på isen för 3-4 h. virvel ibland tills upplöst. Filter för att sterilisera med 2 µm filter och lagra alikvoter vid -20 ° C.
- Förbered serumfritt differentiering (SFD) genom att göra en lösning av 75:25 av IMDM:Ham ' s F-12, tillsätt sedan 0,5% BSA, 1 x B27 och 0,5 x N2 kosttillskott. Förvaras vid 4 ° C. Lägg 1 x L-glutamin, 50 µg/mL askorbinsyra, 400 µM MTG och 150 µg/mL holo-transferrin omedelbart före använda.
- Förbereda serumfritt stamceller kulturmassmedia (t.ex., StemPro, kallad SP34 härefter) per tillverkaren ' anvisningar. Förvaras vid 4 ° C. Lägg 1 x L-glutamin, 50 µg/mL askorbinsyra, 400 µM MTG och 150 µg/mL holo-transferrin omedelbart före använda.
- Bereda 0,2% kollagenas II lösning av Proteinupplösande kollagenas II till en slutlig koncentration på 0,2% w/v i 1:4 FBS:PBS lösning. Lös i 37 ° C vattenbad i minst 15 min. Filter att sterilisera lösning med 2 µm filter och förvara alikvoter vid -20 ° C.
- Förbereda fluorescens aktiverad Cell sortering (FACS) bufferten som en lösning på 5% FBS i IMDM omedelbart före använda.
- Förbereda OP9 media som en lösning av α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-glutamin, och 1 x antibiotika. Filter för att sterilisera med 2 µm filter och förvaras vid 4 ° C.
- Erhålla metylcellulosa-baserade media (t.ex., MethoCult, kallad MeC härefter) som pre-aliquoted 3 mL kvantiteter eller som en 100 mL flaska. Om du använder de 100 mL MeC, vid ankomsten, dela i 2,5 mL alikvoter i 14 mL koniska rör.
Obs: Alla portioner ska förvaras vid-20 ° C. MeC medium alikvoter bör Tinas omedelbart före att använda.
- förbereda en 0,1% w/v lösning av gelatin i PBS. Sterilisera i autoklav och förvaras vid 4 ° C efter alikvotering.
2. Mesoderm differentiering av hPSCs
- växer hPSC cellinjer på MEFs till 70-80% konfluens, i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
Obs: HPSCs bör ha skarp, odifferentierad gränser. - Förbereda MAT-belagd plasticware 24 h innan passaging hPSCs.
Obs: Det totala antalet matta-belagd 6-väl rätter varierar över hPSC linjer. Normalt räcker tre 6-väl rätter per 6-väl maträtt av konfluenta hPSCs på MEFs.- Utför en rättegång feeder-utarmning med olika nyckeltal konfluenta hPSCs:MAT brunnar (1:4, 1:3, 1:2, etc.) innan den första differentieringen att avgöra hur många MAT-belagd 6-väl rätter ska användas för efterföljande differentieringar.
Obs: 24 h efter plätering på matta, i hPSCs bör vara 80-90% konfluenta, med cell klumpar av ungefär 10-20 celler i storlek.
- Utför en rättegång feeder-utarmning med olika nyckeltal konfluenta hPSCs:MAT brunnar (1:4, 1:3, 1:2, etc.) innan den första differentieringen att avgöra hur många MAT-belagd 6-väl rätter ska användas för efterföljande differentieringar.
- Aspirera hPSC media och tillsätt 1 mL 37 ° C 0,25% Trypsin-EDTA till varje brunn för 1 min. Aspirera och tillsätt 1 mL STOP media till varje brunn. Använda en cell-skrapa, skrapa cellerna av plattan. Tillsätt 1 mL tvättlösning till varje brunn.
- Med en 2 mL serologiska Pipettera, hackad 3 - 5 gånger att bryta upp stora klumpar av celler och överföra cellerna till en 50 mL konisk tub. Centrifugera i hPSCs på 330 x g för 5 min.
- Omsuspendera cellerna i en total volym av hPSC medier motsvarande 2 mL per väl av den matta-belagd plasticware som ska användas. Tillsätt 2 mL per brunn av hPSCs till plasticware och inkubera över natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2.
- 24 h senare, aspirera media och ersätta med 37 ° C 0,05% Trypsin-EDTA för 1 min. aspirera på Trypsin-EDTA och tillsätt 1 mL STOP media. Skrapa cellerna kraftigt med en cell skrapa. Tillsätt 1 mL WASH media till varje brunn. Med en 2 mL serologiska Pipettera, pulverisera cellerna 1 - 2 gånger och överför till en 50 mL konisk tub. Centrifugera celler vid 220 x g för 5 min.
Obs: Tidsperiod av Trypsin-EDTA behandling shouLD bestämmas av försöksledaren för varje hPSC rad. Trypsin behandling bör tillämpas så länge som möjligt utan att orsaka encelliga dissociation. Detta steg bör ta loss alla hPSCs från matta-belagda plattorna, men inte resultera i encelliga dissociation. Resulterande EBs bör vara 6-10 celler, genomsnitt. - Aspirera media. Använder en serologisk Pipettera 5 mL, försiktigt resuspendera cellerna i 20 mL WASH media. Centrifugera vid 220 x g under 5 min.
- Blandas försiktigt EBs i dag 0 media (tabell 1). Fördela 2 mL av differentiering media som innehåller EBs i varje brunn för en 6-väl låg-anhängare cell kultur maträtt med en serologisk Pipettera 10 mL. Plats i en 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (Multi gas) inkubator.
Obs: Dag 0 media: SFD media kompletteras med 10 ng/mL BMP4 (tabell 1). Använd en 6-väl låg-anhängare cell kultur maträtt för varje två plattor av hPSCs,. - 24 h senare, tillsätt 2 mL dag 1 media (tabell 1). Inkubera cellerna över natten i en multi gas inkubator.
Obs: Dag 1 media: SFD media kompletteras med 10 ng/mL BMP4 och 10 ng/mL bFGF till varje brunn (tabell 1). - 18 h senare, försiktigt skörda EBs med 5 mL serologiska Pipettera och spinn på 100 x g för 5 min. Tvätta och kombinera hela kulturen med 10 mL IMDM. Spin 100 x g för 5 min. Aspirera media.
Obs: Skräp kommer att finnas i kulturer. Detta centrifugeringssteget vid en låg hastighet (100 x g) kommer att ta bort skräpet. - Återsuspendera försiktigt EBs i SFD media kompletteras med dag 2 media (tabell 1), och sedan fördela 2 mL per brunn i 6-väl låg-anhängare cell kultur plattor. Inkubera i en 37 ° C flera gas inkubator för 30 h.
Obs: Dag 2 media: 10 ng/mL BMP4, och 5 ng/mL bFGF och lämpliga WNT-agonist eller antagonist (tabell 1).- Lägg till 3 µM CHIR99021 ange slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller. Alternativt, lägga till 3 µM IWP2 och 1 ng/mL Activin A Ange primitiva hematopoetiska progenitorceller.
- Fortsätt till avsnitt 3 för hematopoetiska stamceller specifikation.
3. specifikation av CD34 + hematopoetiska progenitorceller
- efter 30 h, isolera EBs med en 2 mL serologiska Pipettera på dag 3 av differentiering. Överföring till en 50 mL konisk rör och centrifugera 330 x g för 5 min. försiktigt Omsuspendera och tvätta med 10 mL IMDM. Centrifugera cellerna igen på 330 x g för 5 min.
- Återsuspendera EBs i dag 3 media (tabell 2) och fördela 2 mL i varje brunn av låg-anhängare 6-väl plattor. Inkubera cellerna i en 37 ° C flera gas inkubator för 72 h.
Obs: Dag 3 media: SP34, kompletterat med 15 ng/mL VEGF och bFGF 5 ng/mL (tabell 2). Lägga till fler media per brunn om pH-värdet i media skördats på dag 3 av differentiering ändrats betydligt (dvs, gul-orange media). Alternativt kan du använda färre EBs per brunn på dag 0. - Efter 72 h för inkubation, tillsätt 2 mL av dag 6 media (tabell 2) till varje brunn. Inkubera i en 37 ° C flera gas inkubator för en ytterligare 48 h.
Obs: Dag 6 media: SP34 media kompletteras med 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 och 50 ng/mL IGF-1 (tabell 2). Om mer media lades till i steg 3.1, sedan lägga till motsvarande mängd media i steg 3,2 så att de slutliga cytokin koncentrationerna förblir desamma. - Isolera CHIR99021-behandlade EBs dag 8 av differentiering. Fortsätt till avsnitt 4.
- IWP2-behandlade EBs skördas dag 8 av differentiering till en 50 mL konisk tub. Centrifugera vid 330 x g under 5 min. Återsuspendera försiktigt i dag 8 media (tabell 2). Inkubera under 24 h i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator i låg vidhäftande rätter. Fortsätt till avsnitt 4.
Obs: Dag 8 media: SP34 media kompletteras med 100 ng/mL SCF, 2 IE EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L och 30 ng/mL IL-3 (tabell 2).
4. Enzymatisk Dissociation av EBs och hematopoetiska stamceller isolering
- isolatet EBs med en serologisk Pipettera till en 50 mL konisk tube. Centrifugera vid 330 x g under 5 min. Aspirera bort supernatanten.
- Tillsätt 2 mL av 0,25% Trypsin-EDTA till EBs. Virvel för 5 s. Inkubera i 37 ° C vattenbad för 8 min. Tillsätt 5 mL av stopplösning. Centrifugera vid 330 x g under 5 min. Aspirera bort supernatanten.
- Återsuspendera EBs i 5 mL kollagenas II. Virvel för 5 s och inkubera i 37 ° C vattenbad. Efter 60 min, virvel för 5 s och tillsätt 5 mL av stopplösning. Snurra på 330 x g för 5 min. Aspirera bort supernatanten.
- I 1 mL FACS buffert, resuspendera cellerna. Passera cellerna genom en sil med 40 µm i cellen. Detta tar bort alla undissociated cell klumpar.
- Räkna cellerna. Alikvotens 1 x 10 6 celler i ett 14 mL koniska rör. Snurra cellerna på 330 x g för 5 min. Omsuspendera cellerna vid en koncentration på 5 x 10 6 celler/mL i FACS buffert. Delprov och pool 10% av cellerna i varje villkor för flöde flödescytometrisk Färgkontroller. Inkubera cellerna i antikroppar i 30 min på isen, i mörkret.
Obs: Se föreslog fluorophore kombinationer i Tabellen för material.- För IWP2-behandlade celler, använder anti-CD34 och anti-CD43 antikroppar.
- För CHIR99021-behandlade celler, använder anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 och anti-CD184 antikroppar.
- Skölj cellerna två gånger med FACS buffert. Snurra på 330 x g för 5 min. Omsuspendera cellerna med en slutlig koncentration på 5 x 10 6 celler/mL.
- Analysera eller isolera cellerna av flödescytometri. För primitiva hematopoetiska progenitorceller, analysera den CD34 och CD43 uttrycket ( figur 2A). För slutgiltig hematopoetiska progenitorceller, isolera han (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) av FACS ( figur 2B). Samla in cellerna i rör som innehåller kyld FACS buffert.
- Att bedöma den slutgiltiga hematopoetiska potentialen från isolerade han, Fortsätt till avsnitt 5 för endothelial-till-hematopoetiska övergången eller avsnitt 7 för T-lymfoida assay. För primitiva hematopoetiska CFC analyser, fortsätta till avsnitt 6.
5. Endothelial-till-hematopoetiska övergången
- Spin den isolerade CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − celler på 330 x g för 5 min. Omsuspendera cellerna i han media på 200 000 celler/mL ( Tabell 2). Distribuera cellerna i 50 µL portioner i en platta med 96 brunnar låg-anhängare cell i kultur. Inkubera cellerna över natten i en 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gas inkubator.
Obs: Han media: SP34 media kompletteras med 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IE EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-L, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL Angiotensin II och 100 µM Losartan kalium på 2 x 10 5 celler/mL (tabell 2). - Förbereda 24-bra MAT-belagda plattor (se steg 1.2.7.1), som behövs.
- Cellerna kommer att sammanställa i klumpar av 6-10 celler över natten. För varje 50 µL volym av reaggregated celler, försiktigt överföra cellerna in i centrera av en 24-bra MAT-belagda platta på nästa morgon. Försiktigt placera plattan i 37 ° C flera gas inkubator för 4-6 h, tills cellerna är kopplade.
- Tillsätt 1 mL färsk han media i varje brunn, efter cellerna är kopplade. Inkubera cellerna i en 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gas inkubator tills de hematopoetiska cellerna syns (vanligen 5-7 dagar. figur 2D). Visualisera under 100 X förstoring med ett ljusmikroskop.
- Skörda de slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller genom att försiktigt ta bort han media från celler. Passera en 40 µm cell SIL detta media och samla. På vidhäftande cellerna i brunnen, tillsätt 0,5 mL 0,25% Trypsin-EDTA till celler och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Lägg till 0,5 mL stopplösning till varje brunn. Passera genom den samma 40 µm cell SIL att samla alla anhängare och icke-anhängare celler tillsammans. Snurra på 330 x g för 5 min.
- För att bedöma CFC potentialen hos denna bulk kultur, gå vidare till avsnitt 6.
- Tvätta cellerna två gånger i FACS buffert. Snurra på 330 x g för 5 min.
- Resuspendera cellerna i FACS buffert på 5 x 10 6 celler/mL. Färga celler med anti-CD45 och anti-CD34 antikroppar i 30 min på is i mörkret (föreslagna fluorophores är i Tabellen för material).
- Tvätta cellerna två gånger i FACS buffert. Snurra på 330 x g för 5 min.
- Isolera CD34 + CD45 + celler av FACS ( figur 2E). Sortera cellerna i kylda FACS buffert.
- Bedöma den slutgiltiga CD34 + CD45 + hematopoetiska progenitorceller som behövs (CFC analysen i avsnitt 6, lymfoida potential i avsnitt 7 eller en annan utredare-initierade assay).
6. CFC Assay
- Tina alikvoter av MeC för varje prov som används för CFC analysen.
- Lägg till cellerna för att analyseras (steg 4.5, 4.7, 5,5 eller 5,9) i MeC. Vortex noggrant och låt MeC kulturer står för 5-10 min tills luftbubblorna försvinna, enligt tillverkaren ' anvisningar. Använda en 16 ½ gauge nål på en 3 mL spruta, ta försiktigt bort 2 mL av MeC.
Obs: Typiska plätering tätheter sträcker sig från 1 000-20 000 celler/mL, beroende på förväntad stamceller frekvensen. - Fördela noggrant, 1 mL MeC cell blandning i varje två 35 mm vävnadsodling rätter. Jämnt fördela MeC i 35 mm rätter genom att försiktigt trycka och vrida skålen. Plats varje av de ovanstående rätterna i en 15 cm vävnadsodling skål fylld med vatten. Inkubera i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Visualisera MeC kulturerna med ljus Mikroskop med 40 gångers förstoring. Kvantifiera de olika klorfluorkarboner som erhållits. Analysera de primitiva CFC analyserna 8-10 dagar efter plätering ( figur 2 c). Analysera de slutgiltiga CFC analyserna 14 dagar efter bordläggningen. Representativa CFC assay kolonin morfologier kan ses i figur 2F.
7. T-Cell Assay att fastställa slutgiltiga hematopoetiska potentiella
- växa den OP9-DL4 celler tills konfluenta i ett 100 mm vävnadsodling maträtt 30 , 31 , 32.
- blidvädret den OP9-DL4 celler 72-96 h före plätering T cell analyserna. Resuspendera OP9-DL4 cellerna i 10 mL OP9 media och fördela i en 10 cm platta. Växa i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator fram till 70-90% konfluenta.
- Att skörda OP9-DL4 cellerna från en 100 mm maträtt, ta bort media och tillsätt 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA för 5 min. Stoppa aktiviteten trypsin med 5 mL OP9 media. Snurra cellerna på 330 x g för 5 min. Omsuspendera cellerna i 1 mL OP9 media och räkna cellerna.
Obs: En 10 cm platta konfluenta OP9-DL4 celler kommer att ge cirka 10 x 10 6 OP9-DL4 celler. - 48 h före T cell analysen, plattan 2 x 10 6 celler i 12 mL OP9 media i en 24-väl maträtt (0,5 mL per brunn). Växa i en 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Lägga till 2 000-10 000 celler att analyseras (som erhålls i steg 4.5, 4.7, 5,5 eller 5,9) 1 väl av OP9-DL4 celler i OP9 media kompletteras med: 30 ng/mL SCF (endast första 6 dagar), 5 ng/mL IL-7 och 5 ng/mL FLT3-L. Inkubera i en 37 ° C 5% CO 2 inc inbubatorverksamhet. Inga media förändringar uppstå i detta steg.
- Varje 4 - 5 dagar, passage T cell föräldraparets på färska OP9-DL4 stromaceller i en 6-väl maträtt. Pulverisera cellerna med en 1 mL Pipettera och passera genom en 40 µm filter att ta bort klumpar. Snurra på 330 x g för 5 min. Aspirera från media. Att resuspendera cellerna i 2 mL färsk OP9 media kompletteras med 5 ng/mL IL-7 5 ng/mL Flt3-L och plats på färska OP9-DL4 celler.
Obs: 48 h före passaging, tallrik 2 x 10 6 färska OP9-DL4 celler i 12 mL OP9 media, och fördela 2 mL per brunn i 6-väl rätter. - Efter minst 21 dagar av samtidig kultur, pulverisera cellerna kraftigt och passera genom en 40 µm filter ta bort cellfragment. Snurra på 330 x g i 5 min och Aspirera supernatanten.
- Tvätta cellerna två gånger i kallt FACS buffert. Snurra på 330 x g för 5 min.
- Resuspendera cellerna i FACS buffert på 5 x 10 6 celler/mL. Fläcken celler med anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 och anti-CD8 antikroppar i 30 min på is i mörkret (föreslagna fluorophore kombinationer är i Tabellen för material). Tillämpa en live/dead cell fläck (DAPI, etc.) för att ta bort skräp från analysen.
- Tvätta cellerna två gånger i FACS buffert. Snurra på 330 x g för 5 min.
- Analysera cellerna med en flödescytometer för att bedöma förekomst av T-lymfocyter stamfäder ( figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk föreställande induktion av primitiva och slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller från hPSCs illustreras i figur 1. Mesoderm mönstring av kanoniska WNT signalering uppstår under dagarna 2-3 av differentiering, följt av hematopoetiska stamceller specifikation.
Representativa flöde flödescytometrisk analys och kolonibildande metylcellulosa analyser av hPSC-härrör hematopoetiska differentiering kulturer visas i figur 2. IWP2-behandlade differentiering kulturer ger en distinkt CD34+CD43− och CD34låg /−CD43+ befolkningen, medan CHIR-behandlade differentiering kulturer kommer att ha < 1% CD43+ celler på dag 8 i differentiering (figur 2AB)26. Primitiva hematopoetiska progenitorceller IWP2 villkor isolerad på dag 9 kommer att ge upphov till huvudsakligen primitiva erytroid (EryP-CFC) och myeloida i metylcellulosa analyserna, medan CHIR-behandlade kulturer kommer att vara till stor del saknar CFC potential i detta skede (figur 2 cF). I stället CD34+CD43– befolkningen härstammar från CHIR99021 behandling är en heterogen befolkning, som innehåller endothelial stamfäder, samt CD34+CD43–CD73–CD184– () han (Se figur 2B), som när isolerade av FACS, initialt bildar en enskiktslager av endothelial-liknande celler (figur 2D, vänstra panelen), som genomgår sedan en endothelial-till-hematopoetiska övergång, vilket resulterar i runda, icke refractile-anhängare hematopoetiska celler (figur 2D, högra panelen). Dessa hematopoetiska celler kan bedömas av flödescytometri för uttrycket av CD34 och CD45 (figur 2E). Hematopoetiska progenitorceller isolerade från EHT analyserna kan användas i metylcellulosa analyser och ge upphov till stora burst-liknande erytroid kolonibildande enheter (BFU-E), små erytroid kolonibildande enheter (CFU-E) och myeloida (CFU-M; Figur 2F).
Figur 3 visar representativa flöde flödescytometrisk analys av T-lymfocyter analyserna potentiella från CHIR99021-derived CD34+CD43−CD73−CD184− hematopoetiska progenitorceller (figur 3A) och IWP2-derived (figur 3B) CD34+CD43− hematopoetiska progenitorceller, efter 21 dagars OP9-DL4 samtidig kultur. Förekomsten av en CD45+CD56−CD4+CD8+ befolkningen i CHIR-derived stamfäder är vägledande slutgiltiga hematopoetiska potential inom den ingående CD34+ befolkning. CD34+ och CD43+ stamfäder isolerade från IWP2-derived differentieringar inte ger upphov till T-lymfocyter i denna analys, enligt dessa differentiering villkor18,26.
Figur 1: Schematisk bild av protokoll för specifikation av definitiv och primitiva hematopoetiska progenitorceller. Skildring av de stora experimentella steg och tidslinjer av differentiering från EBs till definitiv och primitiva hematopoetiska progenitorceller. EBs genereras på dag 0 från hPSCs på mattan-belagd plasticware. EBs odlas i SFD media som innehåller BMP4 i en multi gas inkubator. På dag 1 av differentiering, skall kulturer utfodras med media kompletteras med BMP4 och bFGF. Dag 2 inträffar en media förändring med WNT manipulation genom tillsats av CHIR99021 (CHIR) för slutgiltig hematopoetiska progenitorceller och IWP2 för primitiva hematopoetiska progenitorceller. På dag 3 ändras media till SP34, kompletterat med VEGF och bFGF. På dag 6, skall kulturer utfodras med media kompletteras med hematopoetiska cytokiner. Dag 8 av primitiva hematopoetiska specifikationen, media ändras och celler flyttas till en 5% CO2 inkubator för 24 h, följt av hematopoetiska stamceller cell (HPC) analysen. Dag 8 av slutgiltiga hematopoetiska specifikationen, CD34+CD43–CD73–CD184– celler har isolerats av FACS och analyseras för slutgiltig hemogenic endothelial potential eller T-lymfoida potential (inte avbildas). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av differentiering kulturer och generering av primitiva hematopoetiska progenitorceller. (A) representativa flöde flödescytometrisk analys av primitiva hematopoetiska progenitorceller från IWP2-behandlade EBs dag 8. (B) representativa flödescytometrisk flödesanalyser från CHIR99021-behandlade EBs dag 8. Hemogenic endotel (han) kan identifieras och isolerad som en CD34+CD43–CD73–CD184– befolkning. (C) kolonibildande potentialen i dag 9 hematopoetiska progenitorceller från IWP2- och CHIR99021 - (CHIR) behandlade differentiering kulturer. n = 3, felstaplar representera SD om medelvärdet, asterisker indikerar statistisk signifikans, med Students t-test *** p < 0,0001. (D) representativa fotografier av isolerade han celler efter 4 dagar (vänster) eller 7 + dagar (höger) av tillväxten på mattan-belagd plasticware. Ursprungliga förstoring, 100 X. Skala barer = 100 µm. (E) representativa flödescytometri av CD34 och CD45 uttryck från slutgiltig hematopoetiska progenitorceller efter 9 dagar av kultur. (F) representativt fotografi visar morfologi EryP-CFC (vänster), CFU-M (mitten), BFU-E och CFU-E (höger). Ursprungliga förstoring 40 X. Skala barer = 100 µm. pilarna anger heter kolonier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av slutgiltiga hematopoetiska potential. Representativa flöde flödescytometrisk analyser av T-lymfocyter potential CHIR-derived CD34+CD43−CD73−CD184− hematopoetiska progenitorceller (A) eller IWP2-derived (B) CD34+CD43 − hematopoetiska progenitorceller, 28 dagar efter samtidig kultur med OP9-DL4 celler. T-lymfocyter potential från ett prov betraktas som positivt om det finns mer än 100 CD45+ händelser upptäcks. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: SFD-baserade medier dagar 0 - 2.
| SP34 Media | Dag 3 | Dag 6 | Dag 8 | HAN |
| VEGF | 15 ng/mL | 15 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| bFGF | 5 ng/mL | 5 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| SCF | – | 200 ng/mL | 100 ng/mL | 100 ng/mL |
| EPO | – | 4 IU | 2 IE | 2 IE |
| IL-6 | – | 20 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-11 | – | 10 ng/mL | 5 ng/mL | 5 ng/mL |
| IGF-1 | – | 50 ng/mL | 25 ng/mL | 25 ng/mL |
| TPO | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| FLT - 3L | – | – | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-3 | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| BMP4 | – | – | – | 10 ng/mL |
| SHH | – | – | – | 20 ng/mL |
| Angiotensin II | – | – | – | 10 µg/mL |
| Losartan kalium | – | – | – | 100 ΜM |
Tabell 2: SP34-baserade medier för dagar 3 - 8 och han.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en snabb, serumfritt, stroma-fri metod för differentiering av antingen primitiva eller slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller. Mesodermala specifikation av antingen primitiva eller slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller kan uppnås på ett tillförlitligt sätt med våra protokoll, som unikt utnyttjar småmolekylära hämmare av kanoniska WNT signalering. Scenen-specifika WNT aktivering av den GSK3β-hämmaren CHIR9902133 ger upphov till slutgiltig hematopoetiska mesoderm, medan WNT hämning av den PORCN-hämmaren IWP234 anger primitiva hematopoetiska mesoderm26. Notera ger denna metod inte kraftfullt upphov till en engraftable HSC-liknande befolkning (visas inte). Slutgiltiga hematopoetiska föräldraparets genereras med detta tillvägagångssätt är dock mottaglig för transgenens-inducerad engraftment potentiella35, belysa deras potentiella i framtiden translationell tillämpningar.
En avgörande faktor för framgångsrik hPSC differentiering är den ursprungliga storleken på EBs som bildas från hPSCs. Helst, EBs bör vara runt 6-10 celler i storlek. Den differentiering kulturer kan aberrantly ange en blandning av båda programmen om EBs är för stora, möjligen på grund av felaktig signal aktiveringen inom EB. Differentiering kulturer ska inspekteras visuellt för optimal EB storlek inom de första 24 h differentiering. Alternativt, om hPSCs dissocieras helt att enstaka celler, hPSCs istället genomgå anoikis cell death36, vilket resulterar i dålig hematopoetiska differentiering.
En framgångsrik differentiering kommer att ge upphov till uteslutande primitiva hematopoetiska progenitorceller när IWP2 används under mesodermala specifikation på dag 2 och 3 i denna differentiering protokoll. Dag 8 av differentiering, IWP2-derived kulturen bör bestå av distinkta CD34+CD43−, CD34mid/lågtCD43+, och CD34−CD43+ populationer (figur 2A). CD34mid/lågtCD43+ befolkningen ger upphov till primitiva erytroid och myeloida; medan CD34−CD43+ befolkningen främst ger upphov till erytroid föräldraparets med begränsad myeloisk potentiella18. Primitiva hematopoetiska potential kan bekräftas av metylcellulosa analysen för förekomsten av EryP-CFC (avsnitt 6), som kommer huvudsakligen express den embryonala globinzinkinsulin HBE jämfört med fostrets HBG26, 28,37. Likaså förekomsten av CD43+ hematopoetiska progenitorceller i detta skede kan användas på ett tillförlitligt sätt att indikera förekomst av primitiva hematopoetiska progenitorceller18,23,26. Det bör noteras att CD43 uttryck inte är exklusivt för föräldraparets av primitiva hematopoetiska program18,23,26, och kan inte användas som det enda måttet för att bedöma primitiva hematopoetiska potential, som immunophenotype och NOTCH-beroende av människan EMP förblir uncharacterized (över3).
När CHIR99021 används under mesodermala mallning under dag 2 och 3 av differentiering, kommer en befolkning på enbart slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller att anges. Dag 8 av protokollet differentiering, CHIR99021-derived kulturer bör bestå av en distinkt CD34+CD43− befolkningen, med liten eller ingen CD43 uttryck26. CD34+CD43− befolkningen är en heterogen befolkning av endotelceller med hematopoetiska, venös och arteriell potential som kan avgränsas utifrån CD73 och CD184 uttryck, med han celler saknas uttryck för båda 27,28. När slutgiltig han är isolerad efter att ha genomgått en NOTCH-beroende endothelial-till-hematopoetiska övergången (avsnitt 5)28 kommer det att ge CD34+CD45+ hematopoetiska progenitorceller som kommer att ge upphov till BFU-E och myeloida celler i metylcellulosa, men inte EryP-CFC26,28 (figur 2). Dessutom BFU-E kolonier kan isoleras och bedömas för globinzinkinsulin analys, som kommer huvudsakligen express den fetala globinzinkinsulin HBG i jämförelse med embryonala HBE (visas inte)26,28, 37. däremot lymfoida potential kan bedömas direkt från isolerade han, som NOTCH-beroende endothelial-till-hematopoetiska övergång sker på OP9-DL4 stroma18,26,28. De slutgiltiga han anges med den här metoden innehåller erythro-myelosuppression-lymfoida stamfäder en klonal nivå28, som funktionellt skiljer den från vår nuvarande förståelse av EMP eller LMPP stamfäder3. Som sådan, förekomsten av T-lymfoida och HBG-uttrycker erytroid potentiella, tillsammans med en avsaknad av EryP-CFC potential, kan användas för att på ett tillförlitligt sätt indikera den slutgiltiga hematopoetiska specifikationen från hPSCs. Notera, att enbart bedöma för föräldraparets som kan ge upphov till HBG-uttrycker erytroblaster kan inte exakt fastställa den slutgiltiga potentialen, som, liknar som beskrivs ovan, mänskliga EMP och dess signal krav, har inte varit kännetecknas hittills (ses i referens3).
Denna enkla differentiering strategi är mycket kraftfullt som gör det möjligt för den generation av uteslutande primitiva eller uteslutande slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller, aktivera sjukdom modellering jämförande studier av de två programmen från iPSCs patientderiverade eller gen-modifierat hPSCs. På samma sätt kan människans utvecklingsprocesser förhöras, såsom att upptäcka vilken ytterligare signal väg(ar) krävs att självförnyelse kapacitet och därmed HSC-liknande potential, från de slutgiltiga hematopoetiska progenitorceller.
Sammanfattningsvis, WNT manipulation under mesodermala mönstring i hPSCs anger primitiva CD43+ eller slutgiltiga CD34+CD45+ hematopoetiska progenitorceller, som kan isoleras och används för att studera hPSC-derived blodbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har stötts av den institutionen för invärtesmedicin, avdelningen för hematologi, Washington University School of Medicine. CD stöddes av T32HL007088 från nationella hjärta, lungor och blod Institute. CMS stöddes av en American Society of hematologi Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
