Summary
Vi præsenterer her, humane pluripotente stamceller (hPSC) kultur protokoller, bruges til at differentiere hPSCs i CD34+ hæmatopoietisk stamfaderen. Denne metode bruger fase-specifikke manipulation af canonical WNT signalering til at angive celler udelukkende til enten det endelige eller primitive hæmatopoietisk program.
Abstract
Et af de vigtigste mål for regenerativ medicin er generation og vedligeholdelse af hæmatopoietisk stamceller (HSCs) afledt af humane pluripotente stamceller (hPSCs). Indtil for nylig, har indsatsen for at differentiere hPSCs i HSCs overvejende genereret hæmatopoietisk stamfaderen, der mangle HSC potentiale, og i stedet ligner blommesækken bloddannelsen. Disse resulterende hæmatopoietisk stamfaderen kan have begrænset nytte for in vitro- sygdom modellering af forskellige voksen hæmatopoietisk lidelser, navnlig til lymfoid lineages. Dog har vi for nylig beskrevet metoder til at generere erythro-myelo-lymfoide multilineage endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs ved hjælp af en fase-specifikke styret differentiering protokol, som vi skitsere her. Gennem enzymatisk dissociation af hPSCs på basalmembranen matrix-belagt plasticware dannes embryoid organer (EBs). EBs er differentieret til mesoderm af rekombinante BMP4, som efterfølgende er fastsat til den endelige hæmatopoietisk program GSK3β-hæmmer, CHIR99021. Alternativt, primitive bloddannelsen er angivet ved PORCN-hæmmer, IWP2. Bloddannelsen drives videre gennem tilsætning af rekombinant VEGF og støttende hæmatopoietisk cytokiner. De resulterende hæmatopoietisk stamfaderen genereret ved hjælp af denne metode har potentiale til at blive brugt til sygdom og udviklingsmæssige modellering, in vitro.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) defineres som omfattende både humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeligt inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs), og har den unikke evne til ikke kun undergår selvfornyelse under passende vækstbetingelser, men også kapacitet til at differentiere sig til alle celletyper stammer fra de tre Kim lag: endoderm, mesoderm og ectoderm1. På grund af disse unikke evner holder hPSCs meget lovende for regenerativ medicin, sygdom modellering og cellebaserede behandlinger2. Mens flere celletyper har med succes blevet differentieret fra hPSCs, er en betydelig udfordring i vitro specifikationen af udelukkende voksen-lignende hPSC-afledte hæmatopoietisk stamceller (HSCs) og endelig hæmatopoietisk stamfaderen.
En sandsynlig barriere for udvikling af menneskelige HSCs fra hPSCs er tilstedeværelsen af flere hæmatopoietisk programmer inden for det menneskelige embryo3. Det første program, som opstår, betegnes "primitive bloddannelsen," stammer senest extraembryonic blommesækken væv og kendetegnes bedst ved sin forbigående produktion af erythroblast ophav (EryP-CFC), makrofager og megakaryocytes. Navnlig dette program giver ikke anledning til HSCs, eller giver det anledning til T og B lymfoide stamceller. Dog give blommesækken forbigående anledning til begrænsede endelige hæmatopoietisk progenitorceller, såsom erythro-myeloid stamfader (EMP4,5,6,7,8) og erythroid-mangelfuld lymfoide-pulverlak Multipotente stamfader (LMPP9). Men hverken EMPs eller LMPPs er fuldt multipotente, eller i stand til af HSC-lignende engraftment i voksen modtagere. Derimod senere i udvikling, er klassisk defineret "endelige" hæmatopoietisk programmet angivet i regionen aorta-gonade-mesonephros af embryonet korrekt, giver anledning til alle voksne hæmatopoietisk lineages, herunder HSC. Specifikation af disse intra embryonale endelige hæmatopoietisk celler opstår i en hak-afhængige mode, via en endotel til hæmatopoietisk overgang fra hemogenic endotelet (han)3,10,11 ,12,13,14. Bortset fra rekonstitution kapacitet, kan multilineage potentielle og hak-afhængighed af disse celler bruges til at skelne disse endelige hæmatopoietisk ophav fra EMP og LMPP (gennemgik i referencer3,13 ).
Forståelse af de mekanismer, der regulerer primitive og endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSCs er sandsynligvis afgørende for reproducerbare produktion af endelige hæmatopoietisk stamfaderen på tværs af en bred vifte af hPSC linjer. Indtil for nylig, fandtes hPSC differentiering protokoller, der kunne adskille Multipotente primitive og endelige hæmatopoietisk stamfaderen ikke15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Mange tilgange ved hjælp af føtal bovint serum (FBS) og/eller stromale Co kultur først skitserede hPSC differentiering, hæmatopoietisk potentiale med blandinger af primitive og endelige hæmatopoietisk potentielle15,16, 17,19,22,23,25. Yderligere, mange serumfrit hæmatopoietisk protokoller har beskrevet signal krav til specifikationen af mesoderm fra hPSCs, at havne hæmatopoietisk potentielle18,20,21, 24. dog som disse metoder stadig gav anledning til heterogene blandinger af begge programmer, deres anvendelse i kliniske applikationer og forståelse udviklingsmæssige mekanismer kan være begrænset.
Vi har for nylig bygget på disse undersøgelser, har skitseret de fase-specifikke signal krav til ACTIVIN/NODAL og WNT signalering i primitive og endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSC-afledte mesoderm18,26 . Sidstnævnte var særlig enestående, da dens anvendelse af fase-specifikke WNT signal manipulation giver mulighed for specifikation af enten udelukkende primitive eller udelukkende endelige hæmatopoietisk stamfaderen26. Under mesoderm specifikation, hæmning af canonical WNT signalering med PORCN hæmmer IWP2 resulterer i specifikationen af CD43+ EryP-CFC og myeloide progenitorceller, med ingen påviselige lymfoide potentiale. I skarp kontrast, stimulering af canonical WNT signalering med GSK3β-hæmmer, CHIR99021, under den samme fase af differentiering resulterede i den fuldstændige mangel på påviselig CD43+ EryP-CFC, mens han samtidig førte til den specifikation af CD34+CD43− han. Denne populationen besad myeloid, HBG-udtrykker erythroid og T-lymfoide potentiale. Efterfølgende analyser identificeret dette var han som mangler udtryk for CD7327,28 og CD18428, og dens hæmatopoietisk potentiale NOTCH-afhængige28. Yderligere, enkelt celle klonede analyser viste, at disse endelige hæmatopoietisk lineages kunne udledes af Multipotente enkelt celler28. Taget sammen, tyder disse undersøgelser på, at fase-specifikke WNT signalering manipulation kan angive enten ren primitive hæmatopoietisk progenitorceller, eller Multipotente NOTCH-afhængige endelige hæmatopoietisk stamfaderen.
Her, skitsere vi vores differentiering strategi, der giver udelukkende primitive eller endelige hæmatopoietisk progenitorceller, via manipulation af canonical WNT signalering under mesodermale mønstre, og deres downstream hæmatopoietisk lineage assays. Denne protokol er af stor værdi for efterforskere, der er interesseret i produktion af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs for regenerativ medicin programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagenser
- Hent celle linier; hESCs eller hiPSCs 1, mus embryonale fibroblaster (MEFs) 29, OP9-DL4 stroma 30 , 31.
- reagens
- fremstilles en 0,1% w/v opløsning af gelatine i PBS. Steriliseres ved autoklavering og opbevares ved 4 ° C efter aliquoting.
- Forbered gelatine-belagt plasticware. Pels 6-godt retter med 1,5 mL af 0,1% gelatine løsning. Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Umiddelbart før anvendelsen, Aspirér resterende gelatine løsning.
- Forberede MEF medier ved at gøre IMDM med 15% v/v FBS og 1 x antibiotika. Supplere med 2 mM L-glutamin og 400 µM monothioglycerol (MTG) inden brug og opbevares ved 4 ° C.
- Udarbejde hPSC Kulturmedier som en løsning af DMEM/F12 med 20% v/v knockout serum udskiftning (KOSR), 1 x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 1 x antibiotika, 55 µM β-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin og 10 ng/mL bFGF. Filter til at sterilisere med 2 µm filter og opbevares i mørke ved 4 ° C.
- Forbered serum-gratis vask medier som en løsning af DMEM/F12 med 5% v/v KOSR og 4 mM HCl. Filter til at sterilisere med 2 µm filter, alikvot, og opbevares i mørke ved 4 ° C.
- Gøre en 1 mg/mL DNase jeg løsning ved at opløse DNase jeg i 3-4 timer i iskolde, sterile deioniseret vand på is. Filter til at sterilisere med 2 µm filter og gemme alikvoter ved -20 ° C.
- Forberede stopopløsning med vask medier: tilføje 10% FBS og 10 µg/mL DNase jeg. Stopopløsning bør tilberedes umiddelbart før brugen.
- Forberede basalmembranen matrix (f.eks., matrigel, omtalt som MAT hereon) blanding løsning.
Bemærk: Alle skridt forberede og med MAT blandingen bør udføres på is eller ved 4 ° C. Tø frosne MAT i isen ved 4 ° C natten over. Fortynd MAT 1:1 ved tilsætning af 10 mL iskold IMDM og chill i isen ved 4 ° C natten over. Fortynd MAT blanding med en yderligere 20 mL iskold IMDM og chill i isen ved 4 ° C natten over. Alikvot i pre kølet rør og opbevares ved-20 ° C indtil brug. Når du er klar til brug, tø MAT blanding natten over ved 4 ° C.- Frakke MÅTTEN celle kultur plader.
Bemærk: Alle trin af belægning MAT plader bør udføres på is. Pre chill 6-godt og 24-godt plader ved-20 ° C i mindst 1 time. Når du er klar til at coat plader, placere dem på is. Coat hver brønd med 4 x-fortyndet MAT, fjernelse og genbrug af eventuelle overskydende løsning. Forlade på is i 30-60 min., og Opsug overskydende MAT. Tørre MAT coated pladerne i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator for et minimum af 3 h. brug inden for 72 h belægning.
- Frakke MÅTTEN celle kultur plader.
- Forberede en opløsning af 10% bovint serumalbumin (BSA) ved at opløse 10% w/v BSA i iskold, destilleret, deioniseret vand ved 4 ° C i 3-4 h. Filter til at sterilisere med 2 µm filter i en lys-blokerende flaske og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede ascorbinsyre løsning. Langsomt opløses en 5 mg/mL opløsning af L-ascorbinsyre i iskold, destilleret, deioniseret vand på isen for 3-4 h. Swirl lejlighedsvis indtil opløst. Filter til at sterilisere med 2 µm filter og gemme alikvoter ved -20 ° C.
- Forberede serumfrit differentiering (SFD) medier ved at gøre en løsning af 75:25 af IMDM:Ham ' s F-12, derefter tilsættes 0,5% BSA, 1 x B27 og 0,5 x N2 kosttilskud. Opbevares ved 4 ° C. Tilføj 1 x L-glutamin, 50 µg/mL ascorbinsyre, 400 µM MTG og 150 µg/mL holo-transferrin umiddelbart forudgående bruge.
- Forberede serumfrit stamcelle Kulturmedier (f.eks. StemPro, omtales som SP34 hereon) pr. fabrikanten ' s instruktioner. Opbevares ved 4 ° C. Tilføj 1 x L-glutamin, 50 µg/mL ascorbinsyre, 400 µM MTG og 150 µg/mL holo-transferrin umiddelbart forudgående bruge.
- Forbered 0,2% Collagenase II løsning ved at opløse Collagenase II til en endelig koncentration på 0,2% w/v i 1:4 FBS:PBS løsning. Opløses i 37 ° C vandbad i mindst 15 min. Filter til at sterilisere løsning med 2 µm filter og gemme alikvoter ved -20 ° C.
- Forberede fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) buffer som en løsning på 5% FBS i IMDM umiddelbart forudgående bruge.
- Udarbejde OP9 medier som en løsning af α-MEM, 20% FBS, 2 mM L-glutamin, og 1 x antibiotika. Filter til at sterilisere med 2 µm filter og opbevares ved 4 ° C.
- Få methylcellulose-baserede medier (f.eks. MethoCult, omtales som MeC hereon) som pre-aliquoted 3 mL mængder eller som en 100 mL flaske. Hvis bruger 100 mL MeC, ved ankomsten, opdele i 2,5 mL alikvoter i 14 mL konisk rør.
Bemærk: Alle delprøver skal opbevares ved-20 ° C. MeC medium delprøver skal optøs umiddelbart forud for bruger.
- fremstilles en 0,1% w/v opløsning af gelatine i PBS. Steriliseres ved autoklavering og opbevares ved 4 ° C efter aliquoting.
2. Mesoderm differentiering af hPSCs
- vokse hPSC cellelinjer på MEFs til 70-80% confluency, i et 37 ° C kuvøse med 5% CO 2.
Bemærk: HPSCs skal have skarpe, udifferentierede grænser. - Forberede MAT-belagt plasticware 24 h før passaging hPSCs.
Bemærk: Det samlede antal af MAT-belagt 6-godt retter varierer på tværs af hPSC linjer. Normalt, er tre 6-godt retter tilstrækkelig pr. 6-godt parabol af sammenflydende hPSCs på MEFs.- Udføre en retssag feeder-udtynding med forskellige nøgletal for sammenflydende hPSCs:MAT wells (1:4, 1:3, 1:2, etc.) før den første differentiering til at bestemme hvor mange MAT-belagt 6-godt retter skal bruges til efterfølgende differentieringer.
Bemærk: 24 h efter plating på MÅTTEN, hPSCs skal være 80-90% sammenflydende, med celle klumper af ca 10-20 celler i størrelse.
- Udføre en retssag feeder-udtynding med forskellige nøgletal for sammenflydende hPSCs:MAT wells (1:4, 1:3, 1:2, etc.) før den første differentiering til at bestemme hvor mange MAT-belagt 6-godt retter skal bruges til efterfølgende differentieringer.
- Opsug hPSC medier og tilsættes 1 mL 37 ° C 0,25% Trypsin-EDTA til hver godt i 1 min. aspirat og tilsæt 1 mL STOP medier til hver brønd. Bruger en celle skraber, skrabe celler fra pladen. Tilsæt 1 mL WASH buffer til hver brønd.
- Med en 2 mL serologisk pipette, hakkede 3 - 5 gange til at bryde op store klumper af celler og overføre cellerne til en 50 mL konisk slange. Centrifugeres hPSCs på 330 x g i 5 min.
- Resuspend celler i en samlet maengde paa hPSC medier svarer til 2 mL pr. brønd af MAT-belagt plasticware skal anvendes. Tilføje 2 mL/brønd af hPSCs til plasticware, og der inkuberes natten over i et 37 ° C kuvøse med 5% CO 2.
- 24 timer senere, Aspirér medierne og erstatte med 37 ° C 0,05% Trypsin-EDTA i 1 min. Aspirér Trypsin-EDTA og tilsæt 1 mL STOP medier. Skrab cellerne kraftigt med en celle skraber. Tilsæt 1 mL vask medier til hver brønd. Med en 2 mL serologisk pipette, hakkede cellerne 1 - 2 gange og overføre til en 50 mL konisk slange. Centrifugeres celler på 220 x g i 5 min.
Bemærk: Længden af tid af Trypsin-EDTA behandling should fastsættes af investigator for linjens hPSC. Trypsin behandling bør anvendes så længe som muligt uden at forårsage encellede dissociation. Dette skridt bør frigøre alle hPSCs fra MAT-belagte plader, men ikke resultere i én celle dissociation. Deraf følgende EBs bør være 6-10 celler, gennemsnitligt. - Opsug medierne. Ved hjælp af en serologisk afpipetteres 5 mL, forsigtigt resuspend celler i 20 mL vask medier. Der centrifugeres ved 220 x g i 5 min.
- Resuspend forsigtigt EBs i dag 0 medier (tabel 1). Der afpipetteres 2 mL af differentiering medier indeholdende EBs i hver brønd af et 6-og lav-tilhænger celle kultur parabol ved hjælp af en 10 mL serologisk pipette. Sted i et 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 (multi gas) inkubator.
Bemærk: Dag 0 medier: SFD media suppleret med 10 ng/mL BMP4 (tabel 1). For hver to plader af hPSCs, bruge en 6-og lav-tilhænger celle kultur parabol. - 24 timer senere, tilsættes 2 mL dag 1 media (tabel 1). Inkuber celler natten over i en multi gas inkubator.
Bemærk: Dag 1 medier: SFD media suppleret med 10 ng/mL BMP4 og 10 ng/mL bFGF til hver brønd (tabel 1). - 18 h senere, forsigtigt høste EBs med 5 mL serologisk pipette og spin på 100 x g i 5 min. Skyl og kombinere hele kulturen med 10 mL IMDM. Spin 100 x g i 5 min. aspirat medierne.
Bemærk: Snavs vil eksistere i kulturer. Trinnet centrifugering ved en lav hastighed (100 x g) vil fjerne resterne. - Resuspend forsigtigt EBs i SFD media suppleret med dag 2 medier (tabel 1), og derefter afpipetteres 2 mL pr. brønd i 6-og lav-tilhænger celle kultur plader. Inkuber i et 37 ° C multi gas inkubator for 30 h.
Bemærk: Dag 2 medier: 10 ng/mL BMP4, og 5 ng/mL bFGF, og den relevante WNT agonist eller antagonist (tabel 1).- Tilføje 3 µM CHIR99021 til at angive endelige hæmatopoietisk stamfaderen. Alternativt kan du tilføje 3 µM IWP2 og 1 ng/mL Activin A angive primitive hæmatopoietisk stamfaderen.
- Fortsæt til afsnit 3 for hæmatopoietisk stamfader specifikation.
3. specifikation af CD34 + hæmatopoietisk stamfaderen
- efter 30 h, isolere EBs med en serologisk afpipetteres 2 mL på dag 3 af differentiering. Overførsel til en 50 mL konisk slange og centrifugeres ved 330 x g for 5 min. forsigtigt resuspend og skylles med 10 mL af IMDM. Centrifugeres celler igen på 330 x g i 5 min.
- Resuspend EBs i dag 3 medier (tabel 2) og afpipetteres 2 mL i hver brønd af lav-tilhænger 6-godt plader. Inkuber celler i et 37 ° C multi gas inkubator for 72 h.
Bemærk: Dag 3 medier: SP34, suppleret med 15 ng/mL VEGF og 5 ng/mL bFGF (tabel 2). Tilføje flere medier pr. brønd, hvis pH i medierne høstet på dag 3 af differentiering ændret betydeligt (dvs., gul-orange media). Alternativt kan du bruge færre EBs pr. brønd på dag 0. - Efter 72 h inkubation, tilsættes 2 mL på dag 6 medier (tabel 2) til hver brønd. Inkuber i et 37 ° C multi gas inkubator for en yderligere 48 h.
Bemærk: Dag 6 medier: SP34 media suppleret med 15 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 200 ng/mL SCF, 4 IU EPO, 20 ng/mL IL-6, 10 ng/mL IL-11 og 50 ng/mL IGF-1 (tabel 2). Hvis flere medier blev tilføjet i trin 3.1, derefter tilføje en ækvivalent mængde af medier i trin 3.2, således at de endelige cytokin koncentrationer forbliver den samme. - Isolere den CHIR99021-behandlet EBs på dag 8 af differentiering. Gå til afsnit 4.
- IWP2-behandlede EBs er høstet på dag 8 differentiering i en 50 mL konisk slange. Der centrifugeres ved 330 x g i 5 min. resuspend forsigtigt i dag 8 medier (tabel 2). Der inkuberes i 24 timer i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator i lav vedhængende retter. Gå til afsnit 4.
Bemærk: Dag 8 medier: SP34 media suppleret med 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL Flt3-L og 30 ng/mL IL-3 (tabel 2).
4. Enzymatisk Dissociation af EBs og hæmatopoietisk stamfader Isolation
- isolat EBs med en serologisk afpipetteres i en 50 mL konisk tube. Der centrifugeres ved 330 x g i 5 min. aspirat off supernatanten.
- Tilsættes 2 mL 0,25% Trypsin-EDTA til EBs. Vortex for 5 s. Incubate i et 37 ° C vandbad til 8 min. tilføje 5 mL af stopopløsning. Der centrifugeres ved 330 x g i 5 min. aspirat off supernatanten.
- Resuspend EBs i 5 mL af Collagenase II. Vortex for 5 s og Inkuber i et 37 ° C vandbad. Efter 60 min, vortex for 5 s og tilsættes 5 mL STOP. Spin på 330 x g i 5 min. aspirat off supernatanten.
- I 1 mL af FACS buffer, resuspend cellerne. Passere en 40 µm celle si cellerne. Dette fjerner enhver undissociated celle klumper.
- Tælle cellerne. Alikvot 1 x 10 6 celler ind i en 14 mL konisk rør. Spin celler på 330 x g i 5 min. Resuspend celler i en koncentration på 5 x 10 6 celler/mL i FACS buffer. Delprøve og pool 10% af cellerne i hver tilstand for flow cytometric farve kontrol. Inkuber celler i antistoffer i 30 min på is, i mørke.
Bemærk: Se foreslog fluorophore kombinationer i Tabel af materialer.- For IWP2-behandlede celler, bruge anti-CD34 og anti-CD43 antistoffer.
- For CHIR99021-behandlede celler, bruge anti-CD34, anti-CD43, anti-CD73 og anti-CD184 antistoffer.
- Skylles cellerne to gange ved hjælp af FACS buffer. Spin på 330 x g for 5 min. Resuspend celler i en endelig koncentration på 5 x 10 6 celler/mL.
- Analyser eller isolere cellerne ved flowcytometri. Primitive hæmatopoietisk progenitorceller, analysere CD34 og CD43 udtryk ( figur 2A). For endelige hæmatopoietisk progenitorceller, isolere han (CD34 + CD43 − CD73 − CD184 −) af FACS ( figur 2B). Indsamle cellerne i rør indeholdende kølet FACS buffer.
- Til at vurdere den endelige hæmatopoietisk potentiale fra isolerede han, fortsætte til afsnit 5 i endothelial til hæmatopoietisk overgang, eller afsnit 7 for T-lymfoide assay. For primitive hæmatopoietisk CFC assays, fortsætte til afsnit 6.
5. Endotel til hæmatopoietisk overgangen
- Spin den isolerede CD34 + CD43 − CD73 − CD184 − celler ved 330 x g i 5 min. Resuspend celler i han medier på 200.000 celler/mL ( Tabel 2). Distribuere celler i 50 µL delprøver i en 96-brønd lav-tilhænger celle kultur plade. Inkuber celler natten over i et 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gas inkubator.
Bemærk: Han medier: SP34 media suppleret med 5 ng/mL VEGF, 5 ng/mL bFGF, 100 ng/mL SCF, 2 IU EPO, 10 ng/mL IL-6, 5 ng/mL IL-11, 25 ng/mL IGF-1, 30 ng/mL TPO, 10 ng/mL FLT3-Larsen, 30 ng/mL IL-3, 10 ng/mL BMP4, 20 ng/mL SHH, 10 µg/mL Angiotensin II, og 100 µM Losartan kalium på 2 x 10 5 celler/mL (tabel 2). - Forbereder de 24-godt MAT-belagte plader (Se trin 1.2.7.1), efter behov.
- Celler vil samle ind i klumper af 6-10 celler natten over. For hver 50 µL volumen af reaggregated celler, forsigtigt overføre cellerne ind i midten af en 24-godt MAT-belagt plade på næste morgen. Anbring forsigtigt plade i 37 ° C multi gas inkubator for 4-6 h, indtil cellerne er knyttet.
- Tilsættes 1 mL frisk han medier til hver brønd, når cellerne er knyttet. Inkuber celler i et 37 ° C 5% CO 2 5% O 2 multi gas inkubator, indtil de hæmatopoietisk celler er synlige (typisk 5-7 dage; figur 2D). Visualisere under 100 X forstørrelse ved hjælp af et lysmikroskop.
- Høst endelige hæmatopoietisk stamfaderen ved forsigtigt at fjerne han medier fra celler. Passere en 40 µm celle si dette medie og indsamle. De vedhængende celler i brønden, tilsættes 0,5 mL 0,25% Trypsin-EDTA til celler og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Tilføj 0,5 mL stopopløsning til hver brønd. Passere gennem celler gennem de samme 40 µm celle si til at samle alle tilhænger og ikke-tilhænger celler sammen. Spin på 330 x g i 5 min.
- Til at vurdere CFC af denne bulk kultur, gå videre til afsnit 6.
- Vaske cellerne to gange i FACS buffer. Spin på 330 x g i 5 min.
- Resuspend celler i FACS buffer på 5 x 10 6 celler/mL. Pletten celler med anti-CD45 og anti-CD34 antistoffer i 30 min på is i mørke (foreslog fluorophores er i Tabellen of Materials).
- Vaske cellerne to gange i FACS buffer. Spin på 330 x g i 5 min.
- Isolere CD34 + CD45 + celler ved FACS ( figur 2E). Sortere cellerne i kølet FACS buffer.
- Vurdere den endelige CD34 + CD45 + hæmatopoietisk ophav som nødvendige (CFC analysen i afsnit 6, lymfoide potentiale i afsnit 7, eller en anden investigator-initierede assay).
6. CFC Assay
- tø delprøver af MeC for hver prøve anvendt for CFC assay.
- Tilføje celler for at være analyserede (trin 4.5, 4.7, 5.5 eller 5.9) i MeC. Vortex grundigt og lad MeC kulturer står for 5-10 min indtil luftboblerne sprede, ifølge fabrikanten ' s instruktioner. Ved hjælp af en 16 ½ gauge kanyle på en 3 mL sprøjte, forsigtigt fjerne 2 mL af MeC.
Bemærk: Typisk plating tætheder spænder fra 1.000-20.000 celler/mL, afhængigt af den forventede stamfader frekvens. - Omhyggeligt, afpipetteres 1 mL MeC celle blandingen i hver af to 35 mm vævskultur retter. Jævnt distribuere MeC i 35 mm retter ved forsigtigt at trykke og dreje fadet. Sted hver af de ovennævnte retter i en 15 cm vævskultur skål fyldt med vand. Inkuber i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Visualisere MeC kulturer ved hjælp af en lys mikroskop ved hjælp af 40 X forstørrelse. Kvantificere forskellige CFC opnået. Analysere Primitive CFC assays 8-10 dage efter plating ( figur 2 c). Analysere de endelige CFC assays 14 dage efter plating. Repræsentative CFC assay koloni morfologier kan ses i figur 2F.
7. T-celle analyse at indføre endelige hæmatopoietisk potentielle
- Grow OP9-DL4 celler, indtil sammenflydende i en 100 mm vævskultur fad 30 , 31 , 32.
- tø OP9-DL4 celler 72-96 h før plating T-celle assays. Resuspend OP9-DL4 celler i 10 mL OP9 medier og dispensere til en 10 cm plade. Vokse i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator indtil 70-90% sammenflydende.
- Til at høste OP9 DL4 cellerne fra en 100 mm parabol, fjerne medier og tilsættes 5 mL 0,25% Trypsin-EDTA i 5 min. Stop trypsin aktivitet med 5 mL OP9 medier. Spin celler på 330 x g i 5 min. Resuspend celler i 1 mL OP9 medier og tælle cellerne.
Bemærk: En 10 cm plade af sammenflydende OP9-DL4 celler vil give ca 10 x 10 6 OP9-DL4 celler. - 48 h før T-celle analyse, plade 2 x 10 6 celler i 12 mL OP9 medier i et 24-godt parabol (0,5 mL/hul). Vokse i et 37 ° C 5% CO 2 inkubator.
- Tilføje 2.000-10.000 celler til analyseres (som fremstillet i trin 4.5, 4.7, 5.5 eller 5.9) til 1 godt af OP9-DL4 celler i OP9 medier suppleret med: 30 ng/mL SCF (første 6 dage kun), 5 ng/mL IL-7 og 5 ng/mL FLT3-L. Inkuber i et 37 ° C 5% CO 2 inc ubator. Ingen medieændringer sker på dette trin.
- Hver 4 - 5 dage, passage T-celle stamfaderen på friske OP9-DL4 stromale celler i en 6-godt parabol. Hakkede celler med en 1 mL pipette og passere gennem en 40 µm filter til at fjerne klumper. Spin på 330 x g i 5 min. aspirat fra medierne. Resuspend celler i friske OP9 media suppleret med 5 ng/mL IL-7 og 5 ng/mL Flt3-L og sted på friske OP9-DL4 celler sættes 2 mL.
Bemærk: 48 h før passaging, plade 2 x 10 6 friske OP9-DL4 celler i 12 mL OP9 medier, og distribuere 2 mL/hul i 6-godt retter. - Efter mindst 21 dage efter Co kultur, hakkede celler kraftigt og passere gennem en 40 µm filter til at fjerne celle debris. Spin på 330 x g i 5 min og Opsug supernatanten.
- Vaske cellerne to gange i kolde FACS buffer. Spin på 330 x g i 5 min.
- Resuspend celler i FACS buffer på 5 x 10 6 celler/mL. Pletten celler med anti-CD45, anti-CD56, anti-CD4 og anti-CD8 antistoffer i 30 min på is i mørke (foreslået fluorophore kombinationer er i Tabel af materialer). Anvend live/døde celle pletten (DAPI, osv.) for at fjerne snavs fra analysen.
- Vaske cellerne to gange i FACS buffer. Spin på 330 x g i 5 min.
- Analysere celler ved hjælp af en flow Flowcytometret for at vurdere forekomsten af T-lymfocyt stamfaderen ( figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk skildrer induktion af primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra hPSCs er illustreret i figur 1. Mesoderm mønster af canonical WNT signalering opstår under 2-3 dage af differentiering, efterfulgt af hæmatopoietisk stamfader specifikation.
Repræsentative flow cytometric analyse og kolonidannende methylcellulose assays af hPSC-afledte hæmatopoietisk differentiering kulturer er vist i figur 2. IWP2-behandlede differentiering kulturer vil give en særskilt CD34+CD43− og CD34lav /−CD43+ befolkning, mens CHIR-behandlede differentiering kulturer vil have < 1% CD43+ celler på dag 8 i differentiering (figur 2AB)26. Primitive hæmatopoietisk stamfaderen afledte IWP2 betingelser isoleret på dag 9 vil give anledning til overvejende primitive erythroid (EryP-CFC) og myeloide stamceller i methylcellulose assays, mens CHIR-behandlede kulturer vil være stort set CFC potentiale på dette stadie (fig. 2 cF). I stedet, CD34+CD43- befolkning stammer fra CHIR99021 behandlingen er en heterogen population, indeholdende endotel progenitorceller, samt CD34+CD43-CD73-CD184- () han Figur 2B), som når isoleret af FACS, i første omgang vil danne en éncellelag i endothelial-lignende celler (figur 2D, venstre panel), som derefter gennemgår en endotel til hæmatopoietisk overgang, hvilket resulterer i runde, refractile ikke-tilhænger hæmatopoietisk celler (figur 2D, højre panel). Disse hæmatopoietisk celler kan vurderes ved flowcytometri for udtryk af CD34 og CD45 (figur 2E). Hæmatopoietisk stamfaderen isoleret fra EHT assays kan bruges i methylcellulose assays og give anledning til store burst-lignende erythroid kolonidannende enheder (BFU-E), lille erythroid kolonidannende enheder (CFU-E) og myeloide stamceller (CFU-Møller; Figur 2F).
Figur 3 viser repræsentative flow cytometric analyser af T-lymfocyt assays potentielle fra CHIR99021-afledte CD34+CD43−CD73−CD184− hæmatopoietisk stamfaderen (figur 3A) og IWP2-stammer (figur 3B) CD34+CD43− hæmatopoietisk progenitorceller, efter 21 dage efter OP9-DL4 Co kultur. Tilstedeværelsen af en CD45+CD56−CD4+CD8+ befolkning i CHIR-afledt ophav er vejledende endelige hæmatopoietisk potentiale inden for det input CD34+ befolkning. CD34+ og CD43+ progenitorceller isoleret fra IWP2-afledte differentieringer ikke giver anledning til T-lymfocytter i denne analyse, under disse differentiering betingelser18,26.
Figur 1: skematisk diagram af protokollen til specifikation af endelige og primitive hæmatopoietisk stamfaderen. Skildring af eksperimentelle hovedtrin og tidslinjer af differentiering fra EBs til endelige og primitive hæmatopoietisk stamfaderen. EBs er genereret på dag 0 fra hPSCs på MAT-belagt plasticware. EBs er vokset i SFD medier indeholdende BMP4 i en multi gas inkubator. På dag 1 af differentiering fodres kulturer med media suppleret med BMP4 og bFGF. På dag 2 opstår en ændring af medier med WNT manipulation gennem tilsætning af CHIR99021 (CHIR) for endelige hæmatopoietisk ophav og IWP2 for primitive hæmatopoietisk stamfaderen. På dag 3, er medierne ændret til SP34, suppleret med VEGF og bFGF. På dag 6 fodres kulturer med media suppleret med hæmatopoietisk cytokiner. På dag 8 af de primitive hæmatopoietisk specifikation, medierne er ændret og celler er flyttet til et 5% CO2 inkubator i 24 timer, efterfulgt af hæmatopoietisk stamfader celle (HPC) assay. På dag 8 af endelige hæmatopoietisk specifikation, CD34+CD43-CD73-CD184- celler er isoleret af FACS og analyseres for endelige hemogenic endotel potentiale, eller T-lymfoide potentiale (ikke afbildet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: analyse af differentiering kulturer og generation af primitive hæmatopoietisk stamfaderen. (A) repræsentative flow cytometric analyser af primitive hæmatopoietisk ophav fra IWP2-behandlet EBs på dag 8. (B) repræsentative flow cytometric analyser fra CHIR99021-behandlet EBs på dag 8. Hemogenic endotelet (han) kan være identificeret og isoleret som en CD34+CD43-CD73-CD184- befolkning. (C) kolonidannende potentiale i dag 9 hæmatopoietisk ophav fra IWP2- og CHIR99021 - (CHIR) behandlet differentiering kulturer. n = 3, fejllinjer repræsenterer SD for middelværdien, stjerner angiver Statistisk signifikans, brug af student's t-test *** p < 0,0001. (D) repræsentative fotografier af isolerede han celler efter 4 dage (venstre) eller 7 + dage (til højre) af vækst på MAT-belagt plasticware. Oprindelige forstørrelse, 100 X. Skalere barer = 100 µm. (E) repræsentative flowcytometri af CD34 og CD45 udtryk fra endelige hæmatopoietisk stamfaderen efter 9 dage af kultur. (F) repræsentative fotografi viser morfologi af EryP-CFC (venstre), CFU-Møller (i midten), BFU-E og CFU-E (til højre). Oprindelige forstørrelse, 40 X. Skalere barer = 100 µm. pilene indikerer opkaldt kolonier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af endelige hæmatopoietisk potentiale. Repræsentative flow cytometric analyser af T-lymfocytter potentiale af CHIR-afledte CD34+CD43−CD73−CD184− hæmatopoietisk stamfaderen (A) eller IWP2-stammer (B) CD34+CD43 − hæmatopoietisk progenitorceller, 28 dage efter Co kultur med OP9-DL4 celler. T-lymfocyt potentiale fra en prøve betragtes som positiv, hvis der er mere end 100 CD45+ begivenheder fundet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: SFD-baserede medier til dage 0 - 2.
| SP34 medier | Dag 3 | Dag 6 | Dag 8 | HAN |
| VEGF | 15 ng/mL | 15 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| bFGF | 5 ng/mL | 5 ng/mL | – | 5 ng/mL |
| SCF | – | 200 ng/mL | 100 ng/mL | 100 ng/mL |
| EPO | – | 4 IU | 2 IU | 2 IU |
| IL-6 | – | 20 ng/mL | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-11 | – | 10 ng/mL | 5 ng/mL | 5 ng/mL |
| IGF-1 | – | 50 ng/mL | 25 ng/mL | 25 ng/mL |
| TPO | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| Flt - 3L | – | – | 10 ng/mL | 10 ng/mL |
| IL-3 | – | – | 30 ng/mL | 30 ng/mL |
| BMP4 | – | – | – | 10 ng/mL |
| SHH | – | – | – | 20 ng/mL |
| Angiotensin II | – | – | – | 10 µg/mL |
| Losartan kalium | – | – | – | 100 ΜM |
Tabel 2: SP34-baserede medier til dage 3 - 8, og han.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en hurtig, serumfrit, stroma-fri metode til differentiering af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk stamfaderen. Mesodermale specifikation af enten primitive eller endelige hæmatopoietisk stamfaderen kan opnås pålideligt, ved hjælp af vores protokol, som entydigt udnytter lille molekyle hæmmere af canonical WNT signalering. Fase-specifikke WNT aktivering af GSK3β hæmmer CHIR9902133 giver anledning til endelige hæmatopoietisk mesoderm, hvorimod WNT hæmning af PORCN hæmmer IWP234 angiver primitive hæmatopoietisk mesoderm26. Bemærk give denne metode ikke håndfast anledning til en engraftable HSC-lignende befolkning (ikke vist). Dog er endelige hæmatopoietisk stamfaderen genereret med denne tilgang indstillet til transgen-induceret engraftment potentielle35, fremhæve deres potentielle fremover translationel applikationer.
En afgørende faktor for succesfuld hPSC differentiering er startstørrelsen af EBs, der dannes fra hPSCs. Ideelt, EBs bør være omkring 6-10 celler i størrelse. Differentiering kulturer kan anderledes angive en blanding af begge programmer, hvis EBs er for store, muligvis på grund af forkert signal aktivering indenfor EB. Differentiering kulturer skal inspiceres visuelt for optimal EB størrelse inden for de første 24 timer af differentiering. Alternativt, hvis hPSCs der helt dissocieres til enkelt celler, hPSCs i stedet gennemgå anoikis celle død36, hvilket resulterer i dårlig hæmatopoietisk differentiering.
En vellykket differentiering vil give anledning til udelukkende primitive hæmatopoietisk progenitorceller, når IWP2 er brugt under mesodermale specifikation på dage 2 og 3 i denne differentiering protokol. På dag 8 af differentiering, den IWP2-afledte kultur bør bestå af særskilte CD34+CD43−, CD34mellem/lavCD43+, og CD34−CD43+ populationer (figur 2A). CD34mellem/lavCD43+ befolkning giver anledning til primitive erythroid og myeloide stamceller; mens CD34−CD43+ befolkning primært giver anledning til erythroid progenitorceller med begrænset myeloide potentielle18. Den primitive hæmatopoietisk potentiale kan bekræftes af methylcellulose assay for tilstedeværelsen af EryP-CFC (afsnit 6), hvilke vil overvejende udtrykke den embryonale globin HBE i forhold til fostrets HBG26, 28,37. På samme måde, tilstedeværelsen af CD43+ hæmatopoietisk stamfaderen på dette stadium pålideligt kan bruges til at indikere tilstedeværelsen af primitive hæmatopoietisk stamfaderen18,23,26. Det skal bemærkes, at CD43 udtryk er ikke eksklusivt til stamfaderen til primitive hæmatopoietisk program18,23,26, og kan ikke bruges som den eneste parameter for at vurdere primitive hæmatopoietisk potentiale, som immunophenotype og hak-afhængighed af menneskelige EMP forbliver uncharacterized (gennemgik i3).
Når CHIR99021 er brugt under mesodermale mønstre under dage 2 og 3 af differentiering, angives en befolkning på udelukkende endelige hæmatopoietisk stamfaderen. På dag 8 differentiering protokollen, CHIR99021-afledte kulturer bør bestå af en karakteristisk CD34+CD43− befolkning, med lidt at ingen CD43 udtryk26. CD34+CD43− befolkning er en heterogen population i endothelial celler med hæmatopoietisk, venøs og arteriel potentiale der kan afgrænses baseret på CD73 og CD184 udtryk, med han celler mangler udtryk for begge 27,28. Når endelige han er isoleret efter undergår en hak-afhængige endotel til hæmatopoietisk overgang (afsnit 5)28 det vil give CD34+CD45+ hæmatopoietisk progenitorceller, som vil give anledning til BFU-E og myeloide celler i methylcellulose, men ikke EryP-CFC26,28 (figur 2). Derudover BFU-E kolonier kan isoleres og vurderes for globin analyse, hvilket vil overvejende udtrykke den føtale globin HBG i forhold til embryonale HBE (ikke vist)26,28, 37. I modsætning til lymfoid potentiale kan vurderes direkte fra isolerede han, som NOTCH-afhængige endotel til hæmatopoietisk overgangen forekommer på OP9-DL4 stroma18,26,28. Den endelige han angivet med denne metode indeholder erythro-myelo-lymfoide stamceller på en klonal niveau28, som funktionelt adskiller det fra vores nuværende forståelse af EMP eller LMPP progenitorceller3. Som sådan, tilstedeværelsen af T-lymfoide og HBG-udtrykker erythroid potentielle, kombineret med en manglende EryP-CFC potentiale, kan bruges til at pålideligt angiver den endelige hæmatopoietisk specifikation fra hPSCs. Af note, udelukkende vurdere for stamfaderen, der kan give anledning til HBG-udtrykker erythroblasts kan ikke præcist bestemme den endelige potentiale, som ligner som beskrevet ovenfor, den menneskelige EMP, og dens signal krav, ikke har præget til-dato (gennemgik i reference3).
Denne enkle differentiering strategi er meget kraftfuld, da det giver mulighed for den generation af udelukkende primitive eller udelukkende endelige hæmatopoietisk progenitorceller, aktivering sygdom modellering sammenlignende undersøgelser af de to programmer fra patient-afledte iPSCs eller gen-modificerede hPSCs. Tilsvarende kan menneskelige udviklingsprocesser være afhørt, såsom at opdage hvad ekstra signal virker er forpligtet til at tillægge selvfornyelse kapacitet og dermed HSC-lignende potentiale, fra de endelige hæmatopoietisk stamfaderen.
I Resumé, WNT manipulation under mesodermale mønstre i hPSCs angiver primitive CD43+ eller endelige CD34+CD45+ hæmatopoietisk progenitorceller, som kan isoleres og bruges til at undersøge hPSC-afledte bloddannelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er blevet støttet af Department of Internal Medicine, Division af hæmatologi, Washington University School of Medicine. CD blev støttet af T32HL007088 fra National Heart, Lung, og Blood Institute. CMS blev støttet af en amerikansk samfund hæmatologi Scholar Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, Unit 23.2 (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
