Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por "Acufection" e sua aplicação à Skin Research
Neste artigo
Resumo
Resumo
A desregulação da resposta imune em pele está associado com numerosas desordens da pele humanos. transferência directa de genes imuno-relacionados no tecido da pele é uma abordagem fascinante para investigar a modulação imune de inflamação cutânea em modelos de ratinho de doenças humanas. Aqui apresentamos um protocolo de baixo custo que entregue DNA nu na pele do rato e leva a expressão do transgene. O método é cunhado "acufection", que denota ADN mediada por punção trans fecção acu. Para realizar acufection, pele de ratinho foi infundido em primeiro lugar com ADN em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois picado levemente com um feixe de agulhas de acupunctura para facilitar a absorção de ADN e transfeco em culas. O DNA de plasmídeo é presumivelmente retomado pelo queratinócitos e células dendríticas (DC) na pele e expressa em proteína. Picada mecânica com o agulhas per se não causar danos à pele ou induzir a ativação de queratinócitos. A expressãodos genes transfectados foi detectado na pele, tanto a nível da transcrição e tradução seguintes acufection durante 2 dias e mantiveram-se a 7 dias. O objectivo principal para o desenvolvimento deste método acufection foi investigar uma isoforma anteriormente indefinido de IL-15. Usando este método, um splicing alternativo de IL-15 isoforma com remoção parcial do exão 7 (IL-15ΔE7) foi expressa na pele e subsequentemente tratado com um receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para induzir a inflamação. Acufection-entregue IL-15ΔE7 na pele suprimiu a proliferação de queratinócitos, a espessura da epiderme e o recrutamento de neutrófilos na inflamação cutânea induzida por IMQ. Com o aumento do interesse em identificar os mecanismos de regulação da inflamação cutânea, o protocolo aqui descrito proporciona um custo alternativo eficaz e versátil para o sistema de canh de genes ou microdispersão para entrega de ADN in vivo. Ele pode potencialmente permitir a descoberta da função de um romancegene na pele ou para a investigação de novos tratamentos para doenças cutâneas.
Introdução
A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF 1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
ratinhos fêmea, com 8 - 12 semanas de idade foram usados para este estudo. C57 / BL6 de tipo selvagem (WT) e IL-15 deficientes (IL-15 - / -) foram adquiridos a partir de National Center Animal Laboratory (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, respectivamente. -IL-15 deficientes (IL-15 - / -) e IL-15 dominante (+/- IL-15 e IL-15 + / +) mostrou uma proporção de 1: 3 na segunda geração a partir do cruzamento de heterozigotos de IL-15 +/-. O genótipo de IL-15 - / - ratos foi confirmada por análise de PCR. Camundongos foram mantidos na instalação Specific Pathogen gratuito (SPF) no Laboratório animal Center (LAC),....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Enquanto alguns vermelhidão foi evidente durante a primeira hora depois da punção com agulhas de acupunctura, a pele foi afastada no dia 2, e não se observou qualquer reacção adversa da pele até ao dia 7 após repicagem (Figura 2A). Agulha de perfuração induzida nível muito baixo de ortoceratose epidérmica e dérmica infiltração mínima por meio de análise de H & E em comparação com a pele não tratada (Figura 2B). A espessura d.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A etapa mais crítica para assegurar a expressão do DNA de plasmídeo acufected é a oscilar de forma uniforme e soltar a camada córnea da pele. Ao empurrar as agulhas suavemente sem cortar a pele, a força deve ser forte o suficiente para deprimir a superfície. Para facilitar a absorção de ADN em 10 de soluo de em um 1 cm x 1 centímetro a área de superfície, as agulhas devem oscilar para cima e para baixo para cerca de 100 vezes em 30 s. Pode-se determinar a força que tem de picar a pele e anotando o número de vezes que é .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee em NTU, Leigh Zerboni na Universidade de Stanford e Dr. Peter Hoffmann, da Universidade do Havaí para a leitura do manuscrito, Yun Chien em NTU para assistência técnica, e Dr. Wen-Chi Wei na Agricultura Biotecnologia Centro de pesquisa da Academia Sinica para aconselhamento técnico.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Dispositivo médico |
| NairTM Loção | Igreja & Dwight | N/A | Use para remover o cabelo |
| Shandon Substituto de xilina | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Desparafinização |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anestesia |
| 2-metil-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvente para a dissolução de avertin |
| DifcoTM LB caldo, Miller | BD | 244620 | Propagação e manutenção de E. coli para biologia molecular |
| Kit ELISA Ready-SET-Go complexo de camundongo IL-15/IL-15R | eBioscience | 88-7215 | Medir proteína IL-15 |
| Anti-camundongo Ly6G | BioLegend | 127601 | Anticorpo usado para coloração imuno-histoquímica |
| anti-camundongo Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Anticorpo usado para coloração imuno-histoquímica |
| Coloração simples Mouse MAXPO (Rato) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagente para bloquear o sinal de fundo na coloração de camundongo |
| para camundongo Kit de substrato DAB Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4100 | Substrato de peróxido para coloração imuno-histoquímica |
| Bloco Ultra V | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduzir coloração de fundo inespecífica |
| Metil verde | Sigma-Aldrich | M8884 | Coloração nuclear |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Preservando permanentemente as manchas histoquímicas Comprimidos |
| de coquetel inibidores de protease | Roche | 04-693-116-001 | Inibe a atividade da protease no lisado celular |
| Aldara creme | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod creme |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use para pulverizar o ciclador de ABI7900HT de tecido da pele |
| Thermo Fisher Scientific | N/A | ensaio de PCR quantitativo em tempo real | |
| Filmadora Panasonic | HDC-SD60 | Documentação de imagem | |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Microscopia de campo claro |
Referências
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
