Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por "Acufection" e sua aplicação à Skin Research
Summary
Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea.
Abstract
A desregulação da resposta imune em pele está associado com numerosas desordens da pele humanos. transferência directa de genes imuno-relacionados no tecido da pele é uma abordagem fascinante para investigar a modulação imune de inflamação cutânea em modelos de ratinho de doenças humanas. Aqui apresentamos um protocolo de baixo custo que entregue DNA nu na pele do rato e leva a expressão do transgene. O método é cunhado "acufection", que denota ADN mediada por punção trans fecção acu. Para realizar acufection, pele de ratinho foi infundido em primeiro lugar com ADN em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois picado levemente com um feixe de agulhas de acupunctura para facilitar a absorção de ADN e transfeco em culas. O DNA de plasmídeo é presumivelmente retomado pelo queratinócitos e células dendríticas (DC) na pele e expressa em proteína. Picada mecânica com o agulhas per se não causar danos à pele ou induzir a ativação de queratinócitos. A expressãodos genes transfectados foi detectado na pele, tanto a nível da transcrição e tradução seguintes acufection durante 2 dias e mantiveram-se a 7 dias. O objectivo principal para o desenvolvimento deste método acufection foi investigar uma isoforma anteriormente indefinido de IL-15. Usando este método, um splicing alternativo de IL-15 isoforma com remoção parcial do exão 7 (IL-15ΔE7) foi expressa na pele e subsequentemente tratado com um receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para induzir a inflamação. Acufection-entregue IL-15ΔE7 na pele suprimiu a proliferação de queratinócitos, a espessura da epiderme e o recrutamento de neutrófilos na inflamação cutânea induzida por IMQ. Com o aumento do interesse em identificar os mecanismos de regulação da inflamação cutânea, o protocolo aqui descrito proporciona um custo alternativo eficaz e versátil para o sistema de canh de genes ou microdispersão para entrega de ADN in vivo. Ele pode potencialmente permitir a descoberta da função de um romancegene na pele ou para a investigação de novos tratamentos para doenças cutâneas.
Introduction
A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF 1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células T crónica (por exemplo, dermatite de contacto alérgica e psoríase) 2. Modular as respostas pró-inflamatórias da pele através da inibição da activação KC é uma abordagem aceitável para tratar a inflamação cutânea. Este protocolo descreve uma nova abordagem para expressar transitoriamente um gene de citoquina na epiderme, a fim de estudar res imunesponse como consequência de um tal tratamento na pele.
A epiderme compõe a camada mais superficial da pele. Ele serve como uma barreira física manter as substâncias externas, tais como os ácidos nucleicos e os agentes patogénicos de entrar nas camadas mais profundas da pele. Várias técnicas sem agulha foram estabelecidas para a transferência de ADN epidérmico 3, 4. ADN em solução ou associado com lipossomas catiónicos ou vectores de adenovus foi directamente aplicado à epiderme modificados com técnicas tais como a remoção do estrato córneo ou para o tratamento com depilating reagente. A remoção do epitélio córneo facilita ADN de atravessar a barreira epidérmica e interacção com queratinócitos e células de Langerhans para induzir respostas imunes 5. Enquanto uma grande área de superfície está disponível para transferência de DNA e esta abordagem não envolve agulhas, há desvantagens, incluindo a exigênciapara as grandes quantidades de ADN (10 – 100), o tratamento dura sobre a pele por decapagem e os resultados inconsistentes na indução da resposta imunitária nos animais imunizados, sem reforço de entrega de ADN 6. Entrega intracelular mediada por micropartícula de ADN nu para a pele tem sido mostrado para ser altamente eficiente e reprodutível para a indução de resposta imune 7, 8. Uma pistola de genes de mão tem sido usado para bombardear o local alvo da pele com partículas de ouro revestidas com ADN de plasmídeo de 2 um de diâmetro em tamanho por meio de hélio pressurizado fluxo de ar 9. O DNA de plasmídeo é presumivelmente absorvidos pelas células dendríticas (DC) KCsand na pele e a proteína é expressa localmente ou ser transportado para nódulos linfáticos de drenagem por DCs 10. Embora o sistema arma gene é simples e requer experiência técnica limitada, o custo para a preparação e entrega dos "bul DNAlet "(isto é, pós de ouro, de gás hélio) e para a pistola de genes em si tem limitado a sua aplicação geral. Além disso, o requisito de um sistema de fornecimento de gás hélio limita a facilidade de transporte pistola de genes quando as experiências são realizadas em locais diferentes. microdispersão demonstrou-se conseguir uma maior eficiência de transferência de genes que única injecção e bombardeamento de partículas 11. microdispersão utiliza uma pistola de tatuagem para entregar ADN para a pele sem o uso de grânulos de partículas 11. oscilante as microagulhas na pele utilizando esta abordagem é provável raspar directamente a membrana celular e assim transferir DNA para várias células, ao mesmo tempo. no entanto, a dor associada com o grande número de injecções com agulhas 0,254 mm de diâmetro é uma desvantagem.
Aqui nós fornecemos uma abordagem alternativa para a entrega de ADN in vivo. O "acufection" </strong> protocolo que descrito aqui oferece uma maneira económica e eficaz para entregar o ADN de plasmídeo na pele do rato. Resumidamente, dez agulhas de acupunctura (0,2 mm de diâmetro x 13 mm de comprimento) foram ligados em conjunto por uma fita adesiva. Um volume de 10? L de PBS com 10 ug de ADN de plasmídeo contendo o transgene de interesse foi colocado sobre a pele tratada com creme de barba, creme depilatório flanco. Utilizando o feixe de agulhas de acupuntura para oscilar a superfície (1 cm x 1 cm) da pele, as queratinas na camada córnea foram soltos e o DNA de plasmídeo aplicada à superfície foi absorvido para dentro da epiderme. os danos da pele foi monitorado e encontrado para ser mínima. A expressão do gene transfectado na pele acufected foi confirmada por tanto quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) e ELISA. Os efeitos imunomoduladores dos entregue-acufection IL-15ΔE7 na inflamação cutânea foram demonstrada utilizando o modelo de ratinho tratado com IMQ 12. Enquanto acufection prova ser um dema fácil e menosnding método para entrega de ADN in vivo, a quantidade óptima de ADN para genes diferentes e os tempos para picar a pele tem que ser cuidadosamente optimizadas para obter resultados reprodutíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
A etapa mais crítica para assegurar a expressão do DNA de plasmídeo acufected é a oscilar de forma uniforme e soltar a camada córnea da pele. Ao empurrar as agulhas suavemente sem cortar a pele, a força deve ser forte o suficiente para deprimir a superfície. Para facilitar a absorção de ADN em 10 de soluo de em um 1 cm x 1 centímetro a área de superfície, as agulhas devem oscilar para cima e para baixo para cerca de 100 vezes em 30 s. Pode-se determinar a força que tem de picar a pele e anotando o número d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee em NTU, Leigh Zerboni na Universidade de Stanford e Dr. Peter Hoffmann, da Universidade do Havaí para a leitura do manuscrito, Yun Chien em NTU para assistência técnica, e Dr. Wen-Chi Wei na Agricultura Biotecnologia Centro de pesquisa da Academia Sinica para aconselhamento técnico.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
Referências
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